实时荧光定量PCR 检测食品中常见食源性致病菌

刘雪群

（防城港市上思县疾病预防控制中心，广西 防城港 535599）

0 引言

近年来，随着社会水平不断提升，在日常生活中食物种类越来越丰富，食源性疾病爆发数量不断上升，严重危害居民健康。此次研究的实时荧光定量PCR 检测技术是从定性PCR检测技术上发展而来，其特征为特异性强，能够对DNA 模板进行定量检测，在目前的食品检测应用中取得不错成效[1]，但仍有不足之处需明确并改善。为了进一步探索实时荧光定量PCR 检测技术在食品中的应用，本文对此进行深入分析，旨在对今后的相关工作中提供参考和建议，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料。2016 年3 月至2019 年7 月期间，187 份食品采取实时荧光定量PCR 检测方式进行检测，另外，同时对同等份数食品运用传统方法的进行检测，随机分为研究组和参照组。各年度的检测份数统计为：2016 年72 份，2017 年45 份，2018 年50 份，2019 年15 份。

1.2 方法。参照组采取平板培养、生化反应鉴定及血清学分析法进行检测，操作过程及判断结果严格按照试剂说明标准进行。此次研究采用北京路桥的培养基及生化鉴定试剂盒、宁波天润的诊断血清对187 份食品样品要求进行检测，检测完毕后得出结论。研究组采取实时荧光定量PCR 检测，检测前期首先选择相应培养基上的单个菌落，然后按照具体操作说明提取各菌株的基因组DNA。选取食品样品，此过程需要严格遵守无菌操作流程，加入灭菌处理过的200 mL 液体培养基，设置37℃进行增菌培养，持续24 h，后选择50μg 的增菌液采取DNA 提取，开始检测。检测容器使用核酸检测试剂盒，另外需要采取传统的细菌分离培养鉴定，验证PRC检测结果。最后以菌株的DNA 和食品提取的DNA 作为模板，采取特异性引物与探针进行PCR 扩增。

1.3 观察指标。检测完毕后，对两组食品的检出的食源性致病菌种类以及数量进行对比，对比内容为副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌。

1.4 统计学分析。本文采取SPSS 20 软件处理，计数资料以χ2检验、百分数表示。P<0.05 时表示存在差异，有统计学意义。

2 结果

检测结束后，研究组检出的副溶血性弧菌共7例（3.74%），金黄色葡萄球菌4 例（2.13%），沙门氏菌7 例（3.74%），蜡样芽孢杆菌21 例（11.22%），食源性致病菌总检出率20.85%；参照组检出的副溶血性弧菌共3 例（1.60%），金黄色葡萄球菌2 例（1.06%），沙门氏菌2 例（1.06%），蜡样芽孢杆菌11 例（5.88%），食源性致病菌总检出率9.62%。对比数据有差异，P<0.05，见表1。

表1 食源性致病菌总检出率对比

3 讨论

与传统的食品中常见食源性致病菌检测技术相比，实时荧光定量PCR 技术的革新意义在于从定性到定量完成转变，改善了模板定量不准确等问题[2]。从实际应用意义上分析，实时荧光定量PCR 技术在食源性致病菌的检测中具有高效、快速、特性等优势，在食品安全检测中起到有效的检测保证。从整体分析，实时荧光定量PCR 技术采取全封闭管容器，利用电脑检测软件，对检测物进行持续、实时动态的检测，其中动态评价范围较广，因此具有较高的准确性以及灵敏性。但需要考虑的一点是，实时荧光定量PCR 技术也存在其不足之处，例如在检测过程中需要需要检测相关的特殊仪器与试剂，这导致检测成本高于以往的检测方式[3]。其次，实时荧光定量PCR 检测过程中，有部分因素干扰会致使检测结果不准确。但是随着发展不断深入，检测技术得到完善。如在提高检出准确率方面，为了减少假阳性结果发生，在扩增反应前加入DNA 降解酶，用以消除异源DNA 背景；为了提高检测效率，加入高保真聚合酶提升检测的灵敏性，加速反应[4]。总体来说，实时荧光定量PCR 对食源性致病菌的检测优势明显。

在此次研究中，研究组食源性致病菌总检出率13.69%，参照组食源性致病菌总检出率7.75%，两组数据对比有差异，P<0.05。具体分析为：实时荧光定量PCR 检测技术是在PCR 反应体系中加入荧光集团，根据其对荧光信号的积累情况检测整个PCR 过程，该过程具有较高的实时性[5]。实时荧光定量PCR 是在传统的PCR 上演变而来，采取加入荧光标记探针的手段来实现其定量功能，二加入荧光标记探针的流程为，PCR 在扩增时，当加入一对引物时须同时加入一个特异性荧光探针，当探针完整时，报告基团的荧光发射信号会被基团吸收[6]。起始时，探针结合于DNA 单链上；PCR扩增时，会使报告荧光基团和已淬灭的荧光基团分离，如此便可以检测出相关数据，分析是否存在异常。而检测的依据为，每扩增一条DNA 链，就会有相对应的一个荧光分子形成，从而使荧光信号的累积于PCR 产物形成完全同步，荧光信号的强度随着比例增强。即每收一个荧光信号，随着强度增加，便可以根据强度的变化达到检测目的[7]。总之，实时荧光定量PCR 技术在检测中准确性较高，灵敏性较强，并且在操作过程中自动化高，因此相对方便，另外由于实时荧光定量PCR 检测采取试管密闭性高的特点，可以有效起到防止污染的效果，在应用中的作用越来越明显。

综上所述，在食品中常见食源性致病菌检测工作中，采取常规的检测方式很难保证检测的准确性，但是经过本文研究得出，采取实时荧光定量PCR 技术可以有效提升检测的准确率；同时也可以看出，该检测方式的其他优势同样明显，例如检测中具有较强的特异性，假阳性低，误差小，操作过程自动化程度高的特点，极大保障食品安全，在食品检测中值得推广。