NOTUM基因在骨肉瘤中的表达及临床意义

解克非，金 铎，李大鹏，黄海生

辽宁电力中心医院骨科，辽宁沈阳 110004

骨肉瘤多发于儿童和青少年，是常见的原发性骨恶性肿瘤，易发生转移。骨肉瘤常见于股骨远端(43%)、胫骨近端(23%)或肱骨(10%)，患者会产生剧烈疼痛或病理性骨折等现象，15%～20%的患者伴有病灶转移[1]。近年来，随着新型辅助化疗的应用，骨肉瘤5年生存率从20%提高至目前的50%～70%，但仍有部分患者会面临截肢或死亡危险[2]。因此，探讨骨肉瘤发病机制，寻找影响骨肉瘤发展、预后等关键基因，有可能为骨肉瘤的治疗带来新思路。NOTUM基因最初在果蝇体内发现，参与脊椎动物胚胎时期动物神经和头部生长[3]。NOTUM基因在人体内作为磷脂酰聚糖磷脂酶存在，能够抑制Wnt信号通路，从而影响细胞增殖、分化和凋亡等生理学活动[4]。有报道指出，NOTUM基因在多种肿瘤中呈高表达。胡翀等[5]研究显示，NOTUM基因在胃癌组织中呈高表达，阳性表达患者的生存时间明显低于阴性表达者，可能成为胃癌预后的潜在标志物。目前鲜见关于NOTUM基因在骨肉瘤中的作用的报道，因此，本研究将探讨NOTUM基因在骨肉瘤中的表达及临床意义，以期为骨肉瘤的治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2011年3月至2014年4月来本院就诊的68例骨肉瘤患者，取其癌组织作为试验组，取其正常骨骼肌组织作为对照组。68例骨肉瘤患者中男43例，女25例；年龄8～47岁，平均(21.54±8.32)岁。按肿瘤部位分为胫骨/股骨55例，其他部位13例；按Enneking分期[6]分为Ⅰ～ⅡA期 27例，ⅡB～Ⅲ期41例；按有无远处转移分为有远处转移24例，无远处转移44例；按病理类型分为骨母细胞型27例，软骨母细胞型12例，纤维母细胞型22例，其他类型7例。纳入标准：(1)病理切片确诊为骨肉瘤者；(2)术前未进行放、化疗及药物治疗者；(3)临床资料、随访资料完整者；(4)患者及其家属知情同意，并签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)合并心脏、肝、肾等疾病者；(3)自身免疫性疾病者。对骨肉瘤患者进行随访，为期5年，从术后第1天起，定期记录患者的生存状况，随访日期截至2019年5月1日，存活45例，死亡23例，无失访病例。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 TRIzol Reagent(货号：15596018)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，One Step RT-PCR Kit(货号：210212)购自德国Qiagen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(货号：K1622)购自北京百诺威生物科技有限公司，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(T100型)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，兔抗人NOTUM多克隆抗体(货号：NBP2-33670)购自美国Novus Biologicals公司，免疫组化试剂盒(通用型，货号：AAPR389-A100)购自广州沛瑜生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1样本采集 取骨肉瘤患者术中癌组织作为试验组，取其正常骨骼肌组织作为对照组。将所有的组织样本分为2份，一份用于制作石蜡切片；另一份用于RNA抽提，存于-80 ℃冰箱。

1.3.2qRT-PCR测定骨肉瘤组织中NOTUM mRNA的表达 于-80 ℃冰箱取出组织样本，将样本剪碎装入试管中，加入1 mL TRIzol破碎匀浆，按照TRIzol RNA提取说明书提取组织中总RNA，将所得RNA溶于RNase Free H2O，检测其纯度及浓度。按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，所得cDNA置于-20 ℃保存。qRT-PCR反应体系20 μL： 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，H2O 6 μL。每个样品做3个复孔。根据目的基因设计对应的引物，以β-actin为内参，引物序列见表1。反应条件：94 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40个循环。根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算 NOTUM mRNA相对表达量。

表1 NOTUM及内参基因β-actin引物序列

1.3.3免疫组化检测骨肉瘤组织中NOTUM蛋白的表达情况 石蜡切片脱蜡水化：将切片置于柠檬酸缓冲液中，96 ℃加热10 min，加3% H2O2常温孵育15 min，加EDTA修复液，抗原热修复完成，自然冷却后采用PBS冲洗5 min，重复3次，滴加一抗工作液于湿盒中孵育过夜，PBS冲洗5 min，重复3次，加入二抗孵育30 min，PBS冲洗5 min，重复3次，用二氨基联苯胺(DAB)显色，显色成功后，蒸馏水冲洗，经复染、脱水、透明处理后，封片镜检。结果判定：细胞核或细胞质中存在棕色或棕黄色颗粒即为阳性细胞，在镜下观察切片，随机选取5个视野计数阳性细胞数，1分为阳性细胞数<10%，2分为10%～<50%，3分为50%～<80%，4分为≥80%。根据染色强度：1分为轻度染色，2分为中度染色，3分为强染色。每例样本的总分=阳性细胞率×染色强度，总分1～3分记为阴性，4～12分记为阳性。

2 结 果

2.1qRT-PCR测定组织中NOTUM mRNA表达量 试验组NOTUM mRNA的相对表达量(2.62±0.95)明显高于对照组(0.76±0.28)，差异有统计学意义(t=15.487，P<0.001)。

2.2两组NOTUM蛋白表达情况 试验组NOTUM蛋白的阳性表达率为61.76%(42/68)，明显高于对照组的8.82%(6/68)，差异有统计学意义(χ2=39.441，P<0.001)。

表2 骨肉瘤患者癌组织中NOTUM表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3骨肉瘤患者癌组织中NOTUM表达与临床病理特征的关系 骨肉瘤患者癌组织中NOTUM蛋白阳性率与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径和病理类型无关(P>0.05)，与Enneking分期和远处转移有关(P<0.05)。见表2。

2.4骨肉瘤癌组织中NOTUM表达与患者预后的关系 对骨肉瘤患者随访60个月，生存45例，死亡23例。绘制骨肉瘤患者术后1～60个月NOTUM阳性、阴性患者的生存曲线。NOTUM阳性患者及阴性患者5年的总生存率分别为57.14%(24/42)、80.77%(21/26)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 骨肉瘤癌组织中NOTUM表达阴性、阳性患者5年生存曲线

2.5影响骨肉瘤患者预后的因素分析 单因素分析显示，NOTUM表达、Enneking分期和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的危险因素。多因素分析显示，NOTUM表达和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素。见表3。

表3 影响骨肉瘤患者预后的因素分析

注：HR为风险比。

3 讨 论

骨肉瘤是最常见的骨癌，在儿童和青年中发病率较高，恶性程度高，复发率、转移率高，其特征是肿瘤细胞直接形成未成熟骨或类骨质组织[7]。常见临床症状包括骨骼疼痛及肿胀，严重影响患者生活质量。骨肉瘤的发生、发展受多因子、多基因调控，染色体异常、转录因子调控异常和抑癌基因失活等都可能诱发骨肉瘤[8]。骨肉瘤的新辅助化疗已取得长足进步，但仍有不少患者会出现化疗耐药性或肺转移，造成患者死亡[9]。骨肉瘤的发病机制还未完全明确，目前仍缺乏有效的临床预后指标。

人NOTUM基因最早的名称为LOC147111，是一种α水解酶，位于人染色体17q25.3处，含有11个外显子[10]。NOTUM基因表达可影响Wnt信号通路的传导，从而在肿瘤和其他疾病中发挥作用。Wnt信号通路在指导胚胎发育过程中的细胞生理活动中至关重要，在调节成年组织稳态中同样起重要作用，且Wnt信号的异常激活能够启动编码癌蛋白和细胞周期调节因子基因，从而影响细胞增殖[11]。Wnt信号转导的异常激活与许多癌症有关，Wnt信号转导活性下降，可导致伤口愈合和结构形成不良[12]。已有研究证明，Wnt信号传导异常涉及多种不同类型的癌症。研究表明，NOTUM基因具有一个特殊的结构，状似一个疏水口袋，能够容纳不饱和脂肪酸及其酶活性的性质，此特点可保证NOTUM基因优先作用于Wnt蛋白，从而影响Wnt信号通路[13]。TORISU等[14]研究发现，NOTUM基因在肝癌中呈高表达，其高表达与细胞内β-catenin蛋白的积累显著相关，证明NOTUM基因在Wnt/β-catenin信号激活的肝癌组织中表达上调。DE ROBERTIS等[15]研究表明，NOTUM基因在小鼠结直肠癌组织中呈高表达，其表达与β-catenin蛋白表达呈正相关，但其具体作用部位还未明确。

本研究检测NOTUM基因在骨肉瘤组织中的表达，结果显示，试验组NOTUM mRNA和蛋白表达均明显高于对照组，提示高NOTUM基因和蛋白表达可能在骨肉瘤的发生、发展中发挥作用；骨肉瘤患者癌组织中NOTUM蛋白阳性率与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径和病理类型无关，与Enneking分期和远处转移有关，提示NOTUM表达可能会影响骨肉瘤患者部分病程进展；绘制骨肉瘤患者术后1～60个月生存曲线，结果表明，NOTUM蛋白阴性患者5年生存率明显高于阳性患者，提示NOTUM阳性表达对骨肉瘤患者起预后不良效果；Cox回归分析显示，NOTUM表达、Enneking分期和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的危险因素，其中NOTUM表达和远处转移均是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素，提示抑制NOTUM表达可能会改善骨肉瘤患者的预后状况。

综上所述，骨肉瘤患者癌组织中NOTUM呈高表达，其表达与Enneking分期和远处转移有关，是影响骨肉瘤患者预后的独立危险因素，与患者预后密切相关，有望成为骨肉瘤的潜在治疗靶点。但本研究纳入样本量较少，可能存在一定的局限性，日后将不断扩大样本量，继续深入研究，进一步明确NOTUM基因成为骨肉瘤治疗靶点的可行性。