鸡传染性支气管炎病毒野毒株的鉴定

张新新，赵玉龙，朱秀同，刘浩，赵丽霞，柳珊，吴雅清，李卫东，何平有

（瑞普（保定）生物药业有限公司 河北保定 071000）

鸡传染性支气管炎病（Infectious bronchitis，IB），是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高密度接触性传染疾病，各日龄的鸡均易感，其感染的主要特征是气管啰音、咳嗽和打喷嚏。IBV 还可以侵害鸡的肾脏、输卵管和肠道等组织器官，造成感染鸡发生肾炎或产蛋母鸡的产蛋量及蛋品质的下降，给养鸡业造成严重的经济损失[1]。

IBV 的基因组为不分节段的单股正链RNA，全长约27.6kb，该病毒基因组具有独特的转录合成机制，再加上自然进化、多株免疫和高密度饲养等客观因素造成野毒和疫苗毒大量长期共存，使得IBV 极容易发生点突变、基因缺失、插入以及基因重组等，进而导致IBV 不断产生变异，新的血清型和基因型不断出现[2]。

目前国际上尚缺乏统一的IBV 分类方法，现有的IBV 分型方法主要为基于病毒中和实验（virus neutralisation test，VNT）的血清学分型方法和基于S1 基因序列的基因分型方法。迄今为止已有大量的S1 基因序列登录在GenBank 中，且大部分的研究结构均显示出基因分型与血清学分型结果之间具有高度一致性，又由于VNT 所需的标准阳性血清缺乏公认的权威机构，使得血清学分型方法在实际应用中越来越显示出局限性，因而基因分型成为当前最主流的分型方法。本文通过对IBV 分离株S1 基因的测序分析，对市场免疫失败的鸡只进行了毒株确定，确定病毒为野毒感染，而非来源于疫苗毒。

1 材料与方法

1.1 样品

徐州某鸡场疑似感染IBV 的病料，主要为气管、脾和肺。市场上购买的某A、B 两厂家的IB 活疫苗。

1.2 主要试剂

DNA/RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，RT-PCR 一步法试剂盒、T4 连接酶、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer 购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 IBV S1 基因的RT-PCR

将病料剪成小块，加入适量灭菌的生理盐水进行充分研磨，反复冻融3 次后，4,000r/min 离心10min 后取上清液用于RNA 的抽提。参照GenBank 上公布的IBV 全基因组序列，使用Premier 5.0设计一对通用引物，目的片段包含IBV 完整S1 基因，长约1700bp，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物序列为：

IBV-S1 F：5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′，

IBV-S1 R：5′CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′；

反应体系为：10×Buffer 1μL，MgCl22μL，dNTP Mixture 1μL，RNaseInhibitor0.2μL，AMV RTaseXL 0.2μL，AMV-Optimized Taq 0.2μL，IBV-S1 F 0.4μL，IBV-S1 R 0.4μL，Total RNA 1.4μL，RNase-free Water 3.2μL。反应程序为：50℃30min；95℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30 个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 IBV S1 基因的克隆测序及分析

将上述RT-PCR 产物电泳后进行切胶回收，将纯化产物插入到克隆载体pMD18-T simple 中，再转入Trans1-T1 感受态细胞中，挑取单克隆进行扩繁，菌液进行PCR 扩增，将鉴定含有重组质粒的菌液送往北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 结果

IBV S1 基因的扩增结果显示，病料与A、B 两种疫苗中均有约1,700bp 长的目的条带出现，与预期片段大小一致，如图1。

图1 IBV S1 基因RT-PCR 扩增结果

3 S1 基因测序结果

将阳性重组质粒的测序结果经过序列拼接比对后，发现A、B 两种疫苗株的S1 基因完全相同（标记为#123），与病料中的分离株（标记为#0）进行同源比对，在S1 基因的283 位有碱基差异，疫苗株为碱基G，病料中的分离株为碱基T，其余序列均相同，如图2。

图2 序列比对结果

4 讨论

IBV 793/B 型又称为4/91 型和CR88 型，源于欧洲，侵害鸡只的呼吸系统、生殖系统及肾脏，给欧洲的养禽业造成了巨大损失。Cavanagh 等报道在793/B 野毒株致弱为疫苗毒株的过程中，S1基因出现了一个核苷酸突变283T→G，导致S 蛋白发生一个氨基酸替换95S→A，这可以作为793/B 型分离株来源于野毒或疫苗毒的一个依据[3]。在我国，793/B 型IBV 的流行还尚存争议，我国农业部也未批准使用793/B 疫苗，但是793/B 疫苗却在临床上已有使用。由于IBV 病毒除了自身因基因组内发生点突变、缺失和插入而发生突变形成变异株甚至新的血清型病毒外，该病毒还可以与其他毒株在同时感染一个细胞时发生基因重组而形成新的病毒[4]，因此应慎重选用793/B 疫苗，并且有必要通过持续监测对类793/B毒株的流行趋势和风险进行必要的评估。

S1 蛋白是IBV 的主要结构蛋白，具有重要的生物学功能，S1蛋白含有与病毒中和、血凝抑制抗体、血清型特异性、细胞吸附性、组织亲和性及毒力相关的抗原位点，也是IBV 中变异最大的蛋白，因此S1 基因是IBV 研究的重点。多数学者也是针对于S1 基因序列对IBV 进行基因分型的。

5 结论

本文中对可疑IBV CR88 型疑似病料进行了RT-PCR，并与疫苗株进行了序列比对，确定该病料中毒株为793/B 野毒，而非疫苗毒株。