青年兔与老年兔甲杓肌及环杓后肌组织结构比较△

李翠娥 史艳莉 孙晓玲 周涛 詹娜

据联合国报道，2017年65岁以上的老年人口约占世界总人口的9%，到2050年将达到16%[1]。据估计，约12%～29%的老年人有嗓音障碍[2]，而其中约10%为老年嗓音(presbyphonia)[3]。老年嗓音是指由于喉的老化引起的嗓音年龄相关性变化，患者通常会抱怨声音粗糙度增加，声音不稳定，发声持续时间缩短以及语音质量下降，男性患者嗓音更加尖锐，女性患者的声音则会相对变低沉，并且在嘈杂的环境中，很难让交流对象感知声音信息[4,5]；老年人嗓音音质的这些变化，可能使其感到焦虑和沮丧，甚至回避参与社会活动[6]；因而，老年人的语音问题逐渐成为嗓音工作者的一个新挑战。为了寻求预防和治疗老年嗓音的有效方法，学者们借助大鼠、豚鼠、狗、兔等动物进行了很多研究，其中，就组织的相近程度而言，兔的喉组织结构与人类最接近[7,8]，兔喉非常适用于人喉功能研究；且既往研究证实，老龄哺乳动物的喉内肌发生了许多老化改变，故本研究拟通过比较青年兔与老年兔喉内肌中的甲杓肌(posterior cricoarytenoid muscle，PCA)及环杓侧肌(thyroarytenoid muscle，TA)组织结构变化，探讨喉内肌在老年嗓音发生机制中的可能作用，为老年嗓音的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取健康8月龄雄性大白兔5只作为青年组，体重1.5～2 kg，自然衰老的30月龄雄性大白兔5只作为老年组，体重2.5～3.5 kg。所有动物均购自湖北逸挚诚生物科技有限公司，适应性饲养一周。

1.2甲杓肌和环杓后肌取材 动物腹腔内注射戊巴比妥(10 mg/kg)全麻后，立即取出喉部，分离双侧甲杓肌和环杓后肌，将一侧甲杓肌及环杓侧肌在液氮中快速冷冻，将另一侧甲杓肌及环杓侧肌置于2.5%戊二醛中固定。

1.3甲杓肌及环杓后肌肌纤维横截面积和直径的测量以及肌纤维计数 用-20 ℃恒冷箱切片机将冷冻的甲杓肌及环杓侧肌切片(横切面)，片厚12 μm，HE染色，在光学显微镜下观察环杓后肌和甲杓肌肌纤维形态结构，选择各组TA和PCA染色较好的切片各3张，采用日本LUZEX-F图像分析仪，测量肌纤维的横截面积和直径，每张切片选30个细胞，计算均数；每张切片选取不重叠的3个视野进行肌纤维计数，取均数。

1.4透射电镜观察甲杓肌及环杓后肌的超微结构 取出固定于2.5%戊二醛中的甲杓肌及环杓侧肌，PBS缓冲液洗脱3次，3分钟/次，1%锇酸固定20～30分钟，PBS缓冲液洗脱1次，脱水(50%、70%、80%、90%乙醇各5分钟，1次；100%乙醇4分钟，3次；100%丙酮3分钟，2次)，1∶1丙酮+环氧树脂半浸透，40度2 h，纯环氧树脂全浸透，40度，3.5 h；最后聚合，40度6 h，65度6 h,100度48 h。采用Hitach HT7700(日本日立公司)透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)观察肌纤维的超微结构。

1.5统计学方法 应用SPSS18.0软件包进行数据统计与分析，采用非配对资料t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1青年兔和老年兔甲杓肌和环杓后肌肌纤维的横截面积、直径和计数比较 光学显微镜下，青年兔甲杓肌和环杓后肌的肌纤维均呈规则的平行排列，横纹清晰，肌浆染色后呈现红色，核呈蓝色，肌纤维的横断面大多呈多角形，肌束清晰，肌纤维间结缔组织少(图1)。老年兔的肌纤维则排列较松散，横纹稍少且不清晰，肌浆着色较深，横断面呈多角形，肌束轮廓不甚清晰，肌纤维间结缔组织较青年兔增多(图2)。

青年兔和老年兔甲杓肌和环杓后肌的横截面积、直径和计数见表1，可见，老年兔甲杓肌的横截面积和肌纤维计数较青年兔缩小或减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；老年兔环杓后肌的横截面积、直径及肌纤维计数虽也有所缩小或减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 青年兔和老年兔甲杓肌和环杓后肌肌纤维的横截面积、直径和计数

2.2青年兔和老年兔甲杓肌和环杓后肌肌纤维的超微结构比较 透射电镜下观察，青年兔甲杓肌肌原纤维排列规则(图3a)，肌浆网广泛扩张，未见肌丝溶解，仅见少许轻微的肌丝断裂和和溶解(图3b)，个别细胞肌丝排列不整齐，线粒体无肿胀(图3c)；Z线整齐，肌浆网扩张，线粒体和肌丝正常(图3d)，肌膜下的线粒体未见明显异常；环杓后肌肌浆网扩张，肌丝正常(图4a)，未见肌丝溶解，可见散在的自噬小体(图4b)，个别肌细胞内的线粒体肿胀明显，线粒体嵴断裂(图4c)，肌细胞间的毛细血管内皮细胞正常。老年兔甲杓肌肌纤维排列正常，Z线排列整齐(图5a)，肌细胞核正常，广泛灶性肌丝断裂溶解，线粒体肿胀，线粒体内嵴及肌浆网扩张(图5b)，可见少量脂滴(图5c)， 但未见明显的炎性细胞浸润。老年兔环杓后肌变化较甲杓肌轻，仅见局部小灶性肌丝断裂溶解(图6a)，及小灶性的炎性细胞浸润，线粒体正常(图6b)，肌浆网有不同程度的扩张(图6c)。

图1 青年兔甲杓肌(a)和环杓后肌(b)(HE×40) 图4 青年兔环杓后肌透射电镜图图2 老年兔甲杓肌(a)和环杓后肌(b)(HE×40) 图5 老年兔甲杓肌透射电镜图图3 青年兔甲杓肌透射电镜图图6 老年兔环杓后肌透射电镜图

3 讨论

喉部肌肉包括喉内肌和喉外肌，喉外肌起支撑固定喉部和升降喉的作用，具有不易老化的特点；而喉内肌控制声门和喉入口的开闭以及声带的张力，由于功能精细，使用频繁，其更容易受到老化的不利影响[9]。喉内肌包括甲杓肌、环甲肌、环杓侧肌、环杓后肌和杓肌；根据其功能特征，可分为内收肌、外展肌、紧张声带肌和降低会厌肌四组。内收肌包括环杓侧肌和杓肌，其收缩导致声带内收和声门闭合。环杓后肌收缩时导致声带外展和声门开放，是唯一的外展肌。甲杓肌分为内外两部分，内侧部分称为甲杓内肌即声带肌，外侧部分称为甲杓外肌，紧张声带肌包括声带肌、甲杓外肌和环甲肌，可见，甲杓肌是主要的声带紧张肌。Nishida等[10]研究证实，24月龄大鼠甲杓肌肌纤维的数目减少，但肌纤维直径无变化；而环杓后肌肌纤维的数量和直径都没有明显变化。

从本研究结果看，HE染色光学显微镜下观察，老年兔甲杓肌肌纤维间结缔组织较青年兔明显增多，肌纤维横截面积和肌纤维计数较青年兔显著减少(P<0.05)，而两组间环杓后肌的肌纤维形态及计数均无太大差异，说明老年兔喉部的甲杓肌发生了明显的萎缩，而环杓后肌则萎缩不明显；透射电镜观察显示，与青年兔比较，老年兔甲杓肌发生了广泛灶性肌丝断裂溶解，线粒体肿胀，线粒体内嵴扩张；而环杓后肌的变化较甲杓肌轻，仅见局部小灶性肌丝断裂溶解，及小灶性的炎性细胞浸润，线粒体尚可。本研究结果说明喉内肌的老化改变主要发生在甲杓肌，而环杓后肌的老化改变较甲杓肌轻。

Conner等[11]研究证实，在老化的甲杓肌内，神经肌肉接头结构的改变与失神经支配类似；McMullen等[12,13]研究发现，与6月龄鼠比较，30月龄鼠的甲杓肌易产生颤搐和强直性张力低，最大收缩速度减少20%，去负载收缩速度减少27%，糖元含量增加，抗疲劳性下降，说明随着年龄增加，鼠甲杓肌收缩变弱变慢，且易疲劳。上述关于喉部肌肉与年龄相关性变化的研究及本研究都证实，随着年龄增长，喉内肌发生了不同程度的老化改变，而且控制声带张力主要影响发声功能的甲杓肌退行性变较控制声门开放主要影响呼吸运动的环杓后肌更明显。有研究证实，老化常引起甲杓肌的萎缩性变化从而改变声带边缘的直线状态[2]，喉镜检查的典型表现为弓形声带发声时声门呈梭形裂隙[14]，提示老年嗓音的发生主要与甲杓肌而不是环杓后肌的老化改变有关。

关于衰老对喉组织的影响和年龄相关性的嗓音变化，还有很多需要探索的问题。目前大多研究采用动物模型，而人喉无论是在肌纤维成分、形态结构，还是在利用声带的模式上，均与动物存在明显不同。本研究结果虽提示老年嗓音主要与甲杓肌的老化有关，但还需要进一步证实，并更深入探讨喉内肌老化导致嗓音年龄相关性改变的具体机制。