HPAEC-PAD 法测定霍山石斛中6 种单糖

刘军玲高海涛蒲婧哲张亚中

（1.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051； 2.安徽中医药大学，安徽合肥 230031； 3.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，安徽合肥 230051）

霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 主要含有多糖、生物碱、黄酮类、氨基酸、微量元素等成分，其中糖类作为主要活性物质，对其含有量及组成进行研究具有重要意义［1］。脉冲安培检测器（PAD） 是一种用于测量电活性分子在工作电极表面氧化或还原反应时所产生电流变化的检测器，当发生氧化反应时，电子由电活性被测物质向安培池的工作电极方向转移；当发生还原反应时，电子由工作电极向被测物质方向移动，常用于测定糖类、氨基酸类化合物［2-8］。本研究将该方法与高效阴离子交换色谱（HPEAC） 相结合，引入霍山石斛单糖含有量测定中。

1 材料

ICS-5000 离子色谱仪（戴安Dionex 公司），配置脉冲安培检测器（Au 电极，糖电位四波形）。D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-无水葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、果糖对照品均购自中国食品药品检定研究院。霍山石斛20 批，具体见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 取D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-无水葡萄糖D-甘露糖、果糖适量，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，分别制成0.5、0.5、0.5、5、5、5 mg／mL贮备液，各精密量取1 mL 至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

2.2 供试品溶液制备 取药材0.5 g，精密称定，置于50 mL 具塞三角玻璃瓶中，加入15 mL 去离子水，于65 ℃水浴中超声处理30 min，冷却至室温，离心（8 000 r／min） 20 min。移取上层液体5 mL于50 mL 离心管中，加入无水乙醇20 mL，摇匀后置于4 ℃放置12 h，离心20 min，弃去上清液，残渣用8 mL 水复溶，离心10 min，取2 mL 上清液于耐压反应罐中，加入2 mL 4 mol／L TFA 水溶液，将反应罐置于80 ℃中反应2 h，冷却，反应液在30 ℃下氮气吹干，10 mL 去离子水溶解残渣，取2 mL，去离子水定容至10 mL，即得。溶液过0.22 μm 微孔滤膜和RP 柱后，直接进样分析。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.3 色谱条件 戴安ICS-5000 色谱柱，CarboPac PA20 分析柱（150 mm×3 mm），CarboPac PA20 保护柱（30 mm×3 mm）；安培检测器温度30 ℃；电极材料Au；参比电极pH-Ag／AgCl；电位波形糖四电位；体积流量0.45 mL／min；进样量25 μL；淋洗液梯度洗脱，程序见表2，色谱图见图1。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密称取适量对照品，配制含D-阿拉伯糖0.448 mg／mL、D-半乳糖0.541 mg／mL、D-无水葡萄糖3.582 mg／mL、木糖0.520 mg／mL、甘露糖5.465 mg／mL、果糖0.968 mg／mL的母液，逐级稀释成不同质量浓度，在“2.3”项条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表3，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分离子色谱图Fig.1 Ion chromatograms of various constituents

2.4.2 精密度试验 取对照品贮备液，在“2.3”项条件下进样测定6 次，测得6 种单糖峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，在“2.3”项条件下于0、1、2、4、6、8 h 进样测定，测得D-阿拉伯糖、半乳糖、D-无水葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-果糖峰面积RSD 分别为077%、0.64%、0.80%、0.67%、1.62%、1.83%，表明溶液在8 h 内稳定性良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.4 重复性试验 取同一批药材，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3”项条件下进样测定，测得6 种单糖峰面积RSD 均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取含有量已知的药材6份，每份0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入各对照品溶液适量，在“2.3”项条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4.6 样品含有量测定 取20 批药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下测定，计算含有量，结果见表5。

表5 各成分含有量测定结果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 讨论

3.1 方法优势 HPAEC-PAD 避免了用比色法［9］、分光光度法［10］、GC 法［11］、HPLC 法［12］检测时存在的问题，具有灵敏度高、准确度好、重复性理想的特点。

3.2 条件选择 本实验考察NaOH 淋洗液浓度10、5、3 mmol／L，发现当大于5 mmol／L 时6 种单糖色谱峰有重叠，分离度较低，因此选择3 mmol／L。由于脉冲安培检测器是在碱性条件、电化学响应下实现的，因此每次进样前采用高浓度NaOH（200 mmol／L，5 min） 平衡柱子，并进行再生处理，以避免灵敏度降低。

3.3 多糖分析 霍山石斛中单糖主要为D-甘露糖、D-葡萄糖、果糖，而半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖含有量较低。