木聚糖酶基因(XynB)肠道特异表达载体的构建及鉴定

涂枫 赵为民 曹静

摘要：将黑曲霉属XynB基因和猪RELMβ基因核心启动子区克隆到pcDNA3.1（-）中，构建携带绿色荧光和Myc双标记的肠道特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP。利用脂质体介导将载体转染人结肠癌细胞（HT29）和人肝癌细胞（Bel7402），荧光显微镜检测发现，该载体可在HT29细胞特异表达绿色荧光蛋白;对转染该表达载体的HT29细胞进行RT-PCR检测和WB分析，结果表明，XynB基因在HT29细胞中正常转录，并且在细胞内检测到目的蛋白表达。

关键词：木聚糖酶;特异表达载体;抵抗素样β基因;WB检测;RT-PCR检测

中图分类号： Q786  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0053-04

收稿日期：2019-07-24

基金项目：国家自然科学基金（编号：31872338）;国家生猪现代产业技术体系项目（编号：CARS-35）;江苏省农业重大新品种创制项目（编号：PZCZ201733）。

作者简介：涂枫（1989—），男，江苏南京人，主要从事猪育种研究。E-mail：530538145@qq.com。

通信作者：陈哲，副研究员，主要从事畜禽繁殖和环境控制研究。E-mail：chenzzju@163.com。  木聚糖是含量仅次于纤维素的半纤维素多糖，作为玉米-豆粕型日粮中的主要抗营养因子，无法被单胃动物内源性消化酶独立消化[1]。木聚糖酶（xylanase B，XynB）可以破坏木聚糖的大分子结构，是水解木聚糖的关键酶。黑曲霉属的木聚糖酶具有良好的耐酸性，畜禽胃肠道温度和pH值对该木聚糖酶活性影响不明显，目前木聚糖酶被作为添加剂应用于畜禽和水产饲料生产[2]。考虑到外源性木聚糖酶降解效率和木聚糖存在的广泛性，利用转基因技术实现木聚糖酶在动物肠道内表达，为实现饲料中木聚糖的彻底降解提供可能。

抵抗素样β基因（resistin-like molecule β，RELMβ）是肠道免疫保护相关的重要候选基因，在近端和远端结肠特异性高表达[3]。本研究将黑曲霉属XynB基因和猪RELMβ基因核心启动子区克隆到pcDNA3.1（-）中，拟构建携带绿色荧光和Myc双标记的肠道特异表达载体，旨在为木聚糖酶内源性表达提供材料，也为进一步提高饲料利用率、降低家畜粪便污染提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 pcDNA3.1（-）质粒，购于上海Invitrogen生命技术有限公司;pMD18T质粒，购于大连宝生物有限公司;pRSETA-XynB质粒，由华南农业大学动物科学学院吴珍芳教授课题组构建并惠赠，pEGFP-C3质粒和pMD18-RELMβ（-574～+215）质粒，为笔者所在实验室保存;人结肠腺癌细胞株HT29和人肝癌细胞株Bel7402，购自凯基生物（南京）公司。

1.1.2 主要试剂和工具酶 限制性内切酶NheⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Premix Taq（La Taq version 2.0）酶、DH5α感受态细胞，均购自宝生物（大连）有限公司;中量无内毒素质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、快速连接试剂盒（Liga FastTM Rapid DNA Ligation System）购自Promega公司。

转染试剂盒LipofectamineTM LTX，购自Invitrogen公司;胰酶、PBS、DMEM（高糖）、胎牛血清（FBS）为Gibco产品;抗Myc的小鼠一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化学發光检测试剂，均购于天根生化公司。Western Blot相关试剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司，显影液、定影液，购自南京思泰乐公司。

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc的构建 以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1F/P1R（表1），其中5′端引物P1F带有Xho Ⅰ酶切位点（CTCGAG）及其保护碱基，5′端引物P1R末端引入Myc-Tag序列，带有Kpn Ⅰ酶切位点（GGTACC）及其保护碱基。PCR产物与pMD18T载体连接，构建克隆质粒pMD18-XynB-Myc，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，阳性质粒采用限制性内切酶酶切鉴定并送测序验证。将pcDNA3.1（-）载体和pMD18-XynB-Myc重组质粒分别用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收载体pcDNA3.1（-）和目的片段 XynB-Myc，利用T4连接酶将纯化回收后的 XynB-Myc目的片段连接到线性化的pcDNA3.1（-）载体，构建XynB真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc，连接产物转化DH5α感受态细胞，经过蓝白斑筛选，挑取阳性转化子经过LB液体培养基扩大培养后少量提取质粒，进行酶切鉴定。

1.2.2 pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的构建 根据质粒pcDNA3.1-XynB-Myc设计PCR引物 P1F/P2R（表1），P1F引物5′端带有酶切位点XhoⅠ，P2R引物5′端序列与GFP序列5′末端互补。PCR条件：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s;30个循环;72 ℃ 10 min，扩增的XynB-Myc片段大小为682 bp。以pEGFP-C3序列为模板，设计PCR反应引物 P3F/P3R（表1），P3F的5′端序列与XynB-Myc序列3′末端一致，引物P3R的5′端带有酶切位点Kpn Ⅰ。扩增程序：98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 10 min，扩增的片段大小为768 bp。

以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，使用引物为P1F和P3R，采用重叠PCR方法将2种组件融合，获得XynB-Myc-GFP融合片段（1 398 bp），扩增的程序：98 ℃ 4 min;98 ℃ 10 s，52 ℃ 10 s，72 ℃ 130 s，30个循环;72 ℃ 10 min。扩增的片段大小为1 398 bp。

利用T4连接酶将XynB-Myc-GFP纯化后融合片段与pMD18T连接，得到中间载体pMD18T-XynB-Myc-GFP，双酶切鉴定。采用XhoⅠ和KpnⅠ对pMD18T-XynB-Myc-GFP进行双酶切，回收得到XynB-Myc-GFP片段，克隆至pcDNA3.1（-）相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP，并进行双酶切鉴定。

1.2.3 猪RELMβ基因启动子指导的肠道特异表达载体构建 利用NheⅠ和XhoⅠ对pMD18-RELMβ（-574～+215）和pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP进行双酶切，凝胶回收目的片段，将RELMβ核心启动子片段克隆到pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP，酶切鉴定载体。

1.2.4 XynB在HT29细胞的特异表达 HT29细胞接种于细胞培养孔中，采用脂质体介导转染pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP重组载体，转染12 h后在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况并拍照。

1.2.5 XynB基因在HT29细胞中的表达鉴定 将稳定转染重组表达载体的HT29细胞系复苏，以培养48 h后的细胞总蛋白进行Western-blot试验，选择Myc抗体检测目的蛋白XynB在细胞中的表达。收集培养4 d的转基因HT29细胞系、同代正常培养HT29细胞和空载体转染的HT29细胞抽提RNA，经过DNase处理后，通过RT-PCR检测其转录情况，设计引物扩增XynB-GFP基因片段部分序列，跨内含子β-action内参引物检测用于排除模板DNA污染（表1）。

2 结果与分析

2.1 真核表达载体pcDNA3.1-XynB-Myc的构建

以原核载体pRSETA-XynB为模板，PCR扩增获得目的基因片段XynB-Myc，大小为678 bp（图1-A）。双酶切鉴定显示，XynB-Myc成功连接到pMD18T载体中（图1-B）。重组载体pcDNA3.1-XynB-Myc经双酶切，获得2条条带，与预期相符（图1-C），表明XynB-Myc成功插入到表达载体pcDNA3.1中。

2.2 载体pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP的构建

扩增的XynB-Myc片段大小为682 bp，以pEGFP-C3为模板，扩增的GFP片段大小为 768 bp，XynB-Myc片段及GFP片段为模板，重叠PCR获得XynB-Myc-GFP融合片段，大小为 1 398 bp，酶切产物电泳检测符合预期大小（图2-A）。双酶切鉴定显示，XynB-Myc-GFP成功连接到pMD18T载体中（图2-B）。构建的pcDNA3.1-XynB-Myc-GFP表达载体XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后，凝胶电泳检测，观察到大小符合预期的目的连接片段和空质粒片段（图2-C），表明XynB-Myc-GFP片段成功克隆到pcDNA3.1载体。

2.3 肠道特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP构建

在前期的研究中，对猪RELMβ基因表达特性及启动子活性进行了分析，选择核心启动子区域（-574～+215）作为肠道特异性启动子，克隆至表达载体内。构建的pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP載体双酶切后凝胶电泳检测，观察到大小约为2 000 bp的目的连接片段和空质粒片段，表明RELMβ启动子片段成功插入到pcDNA3.1- XynB-Myc-GFP载体中（图3）。

2.4 XynB在HT29细胞中的特异表达

采用脂质体法，将重组表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP 转染体外培养的HT29细胞，培养12 h时，通过荧光显微镜可以观察到融合表达的绿色荧光蛋白，而在Bel7402细胞转染重组表达载体 12 h 未观察到绿色荧光蛋白表达（图

4）。结果表明，构建的肠道特异表达载体能够指导XynB基因在肠道细胞特异表达。

2.5 XynB基因在HT29细胞表达鉴定

由图5可知，转XynB基因的HT29细胞蛋白中含有目的蛋白，大小约为50 ku，阴性对照组未检测到目的蛋白。

提取RNA为模板，进行RT-PCR检测，由图6可知，转基因HT29细胞内正常转录合成XynB酶mRNA序列。跨内含子引物扩增β-action基因显示无内含子片段扩增，排除了DNA污染可能。

3 讨论

天然的启动子数量众多且各具特点，进行基因重组体外表达研究时，研究者通常采用导入特异启动子来实现目的基因的组织特异性表达。β-乳球

蛋白（β-lactoglobulin，BLG）是反刍动物最主要的乳清蛋白，利用BLG基因启动子和5′端调控序列构建的融合α-抗胰蛋白酶、降钙素和人血清白蛋白等转基因动物均实现目的基因在乳汁的表达[4-6]，在目前科研中广泛用来指导外源基因在乳汁中的表达。腮腺分泌蛋白（parotid secretory protein，PSP）是唾液中特异性高表达的一种蛋白，猪PSP基因是研制猪腮腺转基因生物反应器及进行转基因育种研究的最佳候选基因[7-8]，绵羊毛囊角蛋白关联蛋白（keratin-associated protein 6.1，KAP6.1）基因已被证实在绵羊毛囊中特异表达[9]，针对这一特点，已用绵羊KAP6.1启动子构建了一系列毛囊特异表达载体[10-11]。

RELMβ基因已被證实在啮齿动物和人的肠道组织特异表达[3]。研究表明，RELMβ基因启动子区包含多个肠上皮特异性转录调控因子，而启动子区（-574～+215）片段是核心区域，包含有关键顺式作用元件[12]。本研究构建的表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP在肠道特异表达启动子RELMβ调控下，可有效指导XynB在肠细胞系HT29特异表达;下一步将利用体外细胞培养试验，测定构建的重组载体真核表达分泌和酶活性，以及分泌的XynB酶稳定性、最适pH值等，为运用转基因技术实现XynB内源性表达提供重要材料。

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