牦牛源枯草芽孢杆菌的益生作用研究

王琦 谢晓佩 吴庆侠

摘要：益生枯草芽孢杆菌可以替代部分抗生素，安全无污染，在临床上具备治疗、预防细菌性肠道疾病的功效。为研究牦牛源枯草芽孢杆菌对大肠埃希氏菌是否具有益生作用，试验采用体外抑菌试验、药敏试验、大肠埃希氏菌攻毒和制作石蜡切片观察肠道组织变化的方法，探究其益生作用。结果表明，在4株牦牛源枯草芽孢杆菌中，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直径达到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直径分别达到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。从病理切片得出，试验组肠道组织较对照组大幅改善。因此，该菌具有治疗大肠埃希氏菌疾病的作用，有作为益生菌株的潜能，为西藏地区益生菌种提供了参考。

关键词：牦牛源枯草芽孢杆菌;益生作用;大肠埃希氏菌;治疗;切片

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0157-09

收稿日期：2019-07-02

基金项目：西藏自治区重点研发及转化计划（编号：XZ201902NB05）;西藏自治区科技重大专项（编号：XZ201901NA02）;国家肉牛牦牛产业技术体系（编号：CARS-37）。

作者簡介：王 琦（1997—），女，山东泰安人，从事动物医学研究。E-mail：1154101489@qq.com。

通信作者：吴庆侠，博士，副教授，研究方向为动物疾病病理研究。E-mail：goodwqx@163.com。  在集约化、规模化的动物生产模式下，畜禽舍诸多应激因子富集，致使动物机体免疫力下降，发病率大幅提高。我国从20世纪80年代开始使用抗生素，以此来预防、治疗细菌感染，促进动物生长[1]。长期以来，应用抗生素治疗细菌性疾病的方法虽对畜禽疾病有显著成果，但随着抗生素的普及甚至滥用，却给社会带来了药物残留、病菌产生耐药性、环境污染等多种问题，直接危害人类健康[2]。严格控制抗生素的使用，杜绝其滥用已成为各国的共识。因此，寻求无污染、无毒副作用、无药物残留、效果好的微生态制剂已成为研究的热点[3-4]。抗生素的替代品有多种，而在众多替代品中，益生菌作为一种无毒、无害、无药物残留、无耐药性的微生态制剂，有利于平衡肠道内的菌群，可治疗、预防细菌性疾病，已成为动物疾病防治的新选择[5]。

长期以来，腹泻一直是困扰动物行业的一个重要问题，大量甚至过量使用抗生素，虽然能在短期内奏效，但缺乏长期可持续效果[6]。由于抗生素的普遍使用，致使外界环境和动物体内的细菌对现在所使用的抗生素都表现出不同程度的耐药性，因此寻求一种新的安全有效、无污染的抗生素替代物对动物行业的可持续发展至关重要[6]。与此同时，西藏牦牛多发春季腹泻，现阶段开发的枯草芽孢杆菌制品并不能完全科学高效地适应西藏牧区的需要，因此筛选出安全、科学、有效的适宜高原动物使用的具有益生性能的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）至关重要。

1 试验材料

1.1 菌株

耐肠液耐胆盐的牦牛源枯草芽孢杆菌4株（Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7），均由西藏农牧学院兽医临床重点实验室分离保存。

大肠埃希氏菌（血清型O111），由西藏农牧学院兽医临床重点实验室提供;金黄色葡萄球菌（ATCC29213），由南京合益生物技术有限公司供给。

1.2 试验动物

4只健康家兔购自林芝某农贸市场。

1.3 主要试剂及试剂盒

药敏纸片、营养琼脂（NA）、枯草芽孢杆菌选择培养基、伊红美蓝琼脂、营养肉汤（NB）、麦康凯琼脂均购自杭州滨和微生物试剂设备有限公司;95%乙醇、切片石蜡、二甲苯均购自成都市联合化工试剂研究所;苏木精染色液（A液）、伊红染液（醇溶型）（B液）、分化液（C液）、返蓝液（D液）、10%福尔马林中性固定液均购自南昌雨露实验设备有限公司。

1.4 主要仪器

LRH-150生化培养箱、干热消毒箱均购自上海森信实验仪器有限公司;Jan-90磁力搅拌器、电子天平、HH S-2数显恒温水浴锅、HNY-2112B恒温振荡器均购自金坛市盛蓝仪器制造有限公司;台式高速离心机购自长沙湘鹰离心机有限公司;TDZ4-WS台式低速离心机购自湖南湘仪离心机仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂;倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司;QP-3168转轮式石蜡切片机、TEC-2800病理组织包埋冷冻台、TEC-2800组织包埋机均购自常州市郝思林医用仪器有限公司;超净工作台购自苏净安泰空气技术有限公司。

2 试验方法

2.1 菌液复苏

取于-80 ℃冰箱保存的枯草芽孢杆菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的菌液各 1 mL，将其接种于B.subtilis选择培养基上，在37 ℃恒温培养箱培养24 h，将菌复苏，然后用接种环选取单个菌落，接种于100 mL NB培养基中，在37 ℃恒温摇床中培养12 h，以增强细菌活力[7]。

2.2 牦牛源枯草芽孢杆菌的抑菌试验

对复苏的4株牦牛源枯草芽孢杆菌的12 h培养物3 500 r/min离心5 min。将指示菌大肠埃希菌（血清型O111）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）复苏，指示菌菌液浓度稀释至10万 CFU/mL。分别取已稀释好的大肠埃希氏菌（血清型O111）菌液 0.4 mL 和金黄色葡萄球菌菌液0.4 mL，用灭菌的三角环均匀涂布在麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基和NA培养基上，用镊子取出已被灭菌的牛津杯，轻轻放在已涂布过大肠杆菌O111菌液的麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基和涂布过金黄色葡萄球菌菌液的NA培养基上，每个培养基上放4只牛津杯，注意4只牛津杯的分布位置要均匀。然后将其放入4 ℃冰箱中，30 min后取出。分别吸取 0.25 mL 离心后的Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7的上清液，然后分别注入4个牛津杯中[8]，先将其放入4 ℃冰箱扩散24 h，然后接着将其放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察有无抑菌圈产生，用游标卡尺精准测量抑菌圈直径[9]。该试验操作3次，取平均值。

2.3 牦牛源枯草芽孢杆菌的药敏试验

采用K-B纸片扩散法，根据抑菌圈直径判断分离的菌株对于常见的抗菌药物是否敏感[10]。

复苏菌液：用接种环挑取单个菌落接种于NB培养基中，于37 ℃恒温摇床中培养12 h，进行增菌。取0.4 mL已稀释好的枯草芽孢杆菌菌液，用灭菌的三角环均匀涂布在枯草芽孢杆菌选择培养基上，待菌液干后，用灭菌镊子取药敏纸片均匀贴于培养基表面。37 ℃恒温培养24 h。24 h后将其拿出，用游标卡尺精准测量抑菌圈直径[11]。该试验操作3次，取平均值。

2.4 牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治疗作用研究

2.4.1 动物试验设计 在林芝农贸市场购买4只状态良好的家兔，经临床检查4只家兔均健康。将家兔随机分为2组。4只健康家兔分别编号为1#、2#、3#、4#。1#、2#为对照组，3#、4#为试验组。试验过程中，2组兔单独饲养，饲养环境保持通风，饲料、饮水保证充足，卫生状况条件良好。饲喂周期为14 d。

试验进行到15 d时，将大肠埃希氏菌（血清型O111）经37 ℃恒温摇床培養12 h后离心，收集菌体，将菌液调整到攻毒浓度[12]，对4只家兔采用腹腔注射的方法注射大肠埃希氏菌（血清型O111）。每日注射浓度为10亿CFU/mL的大肠埃希氏菌（血清型O111），5 mL/只，1次/d，连续注射4 d。4只家兔均腹泻，腹泻率为100%。对照组2只家兔不作处理，使其自然止泻，其中1只死亡，死亡率为50%。给试验组2只家兔灌服牦牛源枯草芽孢杆菌菌液，灌服剂量均为20 mL/只，1次/d，连续给药7 d，每日观察家兔腹泻情况以及对照组和试验组家兔止泻情况，并记录[13]。

2.4.2 肠道病理组织观察 连续给药7 d后给兔耳静脉注射空气，将3只（共4只家兔，其中1只死于腹泻）家兔处死，取材，制作石蜡切片。取材时打开腹腔，将整个消化管取出，观察是否有出血斑、出血点等病变现象，找到健康组织与病变组织的交界处，10 min内分段取材，分别取十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠各1 cm3，然后用10%中性福尔马林固定液固定。制作石蜡切片时将病变组织切成5 mm大小，制作成石蜡切片（厚度为 6 μm），最后用苏木素-伊红染色，用光学显微镜观察组织病理变化情况。石蜡切片制作过程参照《家畜组织学与胚胎学实验指导》完成，并做部分修改[14]。

3 结果与分析

对4株枯草芽孢杆菌进行了大肠埃希氏菌（血清型O111）、金黄色葡萄球菌的抑菌试验。4个菌株对大肠埃希氏菌（血清型O111）和金黄色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同。其中，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6对致病菌的抑制能力较强，Yak-KC7对致病菌的抑制能力最佳。

3.1 抑菌试验结果

4株牦牛源枯草芽孢杆菌对大肠埃希氏菌（血清型O111）和金黄色葡萄球菌都具有抑菌作用，但抑菌效果不同[15]。对金黄色葡萄球菌，Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直径最大，达到26 mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直径分别达到（16±1）、（20±2）、（20±1） mm。对大肠埃希氏菌（血清型O111），Yak-KC7的抑菌效果最佳，抑菌直径达到（25±1） mm;其次是Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6，抑菌直径分别达到（17±1）、（22±2）、（20±2） mm。抑菌圈直径详见表1和图1至图9。

3.2 药敏试验结果

采用K-B纸片扩散法，选取20种常用药物做试验，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7对于链霉素具有中度敏感性，说明4个株菌对链霉素有一定的耐受性;而对于绝大多数的药物敏感，不具有耐受性。试验结果表明，Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7均无耐药性，无携带耐药基因的风险。在使用益生枯草芽孢杆菌时，不应与其敏感的抗生素一起使用，这是保证益生菌发挥作用的关键[16]，这样既可提高动物的抵抗力，又可增强微生态制剂的应用效果。药物敏感试验结果详见表2。药敏试验抑菌圈直径见图10至图12。

3.3 牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治疗作用

用筛选出的益生性能最佳的枯草芽孢杆菌 Yak-KC7，探究其对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治疗作用。

攻毒对照组2只家兔腹泻率为100%，自然止泻，不作任何处理，死亡率为50%，死亡前，精神状态不佳，喜卧，被毛粗乱无光泽;死亡后，粪便有特殊气味，恶臭，呈稀糊状，颜色为黄绿色。家兔肛门尾部及其周围附有黏粪，详见图13。试验组腹泻率100%，死亡率0%。给药7 d后，观察腹泻情况，实验组家兔经Yak-KC7的治疗，剂量20 mL/头，1次/d，共给药7 d，无死亡，详见图14。制作石蜡切片观察肠道组织变化，结果表明牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔具有明显的治疗作用，详见图15至图38。

由病理组织切片可观察到，对照组十二指肠肠壁绒毛逐渐开始溶解，绒毛变短且排列稀疏;试验组十二指肠绒毛排列紧密并增长，似圆指状。对照组空肠绒毛与肠壁分离，绒毛上段断裂，细胞排列混乱;试验组空肠绒毛断裂减轻，肠壁与肠绒毛未分离，细胞间连接正常。对照组回肠肠壁绒毛与肠壁分离，绒毛中段破碎严重，细胞间的连接结构发生变形;试验组回肠绒毛破碎减轻，未出现绒毛与肠壁分离现象。对照组盲肠部分肠壁绒毛断裂;试验组盲肠破坏程度大大减轻。对照组结肠绒毛严重破碎，细胞排列混乱、混淆不清，绒毛与肠壁开始

分离;试验组结肠绒毛破碎减轻。对照组直肠与试验组直肠无显著性差异。

综上， 试验组肠道病理变化较对照组肠道病理变化均大幅改善。对照组肠道损伤较大，刷状缘损伤，微绒毛萎缩，上皮细胞排列紊乱。具体表现为

肠黏膜水肿、萎缩、坏死，细胞排列混乱，肠壁脱落明显，细胞间的连接结构扭曲。结构变化导致功能受损， 导致动物严重腹泻。试验组经牦牛源枯草芽

孢杆菌Yak-KC7治疗，绒毛水肿现象、黏膜病理变化显著改善，绒毛高度明显增加，排列更紧凑整齐，上皮细胞无脱落现象[17-21]。

4 讨论

益生枯草芽孢杆菌作为一种生物拮抗剂，有利

于平衡肠道菌群，还能够治疗、预防细菌性疾病[22]。且由于能够产生芽孢，在长期储存甚至恶劣环境中仍可以保证活菌数，因此成为了益生菌的热选方向

之一[23]。本试验便是通过给被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔灌服牦牛源枯草芽孢杆菌 Yak-KC7，探究其对家兔肠道组织是否具有益生作用。

郭梦娇在研究中指出，尽管许多科研结果表明B.subtilis具有益生菌的潜力和功能，但B.subtilis至今在市场上没有得到很好的应用。研究表明，主要原因是没有性能足够优良的菌种用于实际生产[21]。

4.1 抑菌试验

研究证明，大多数芽孢杆菌对革兰氏阳性和革兰氏阴性有致病能力的菌都有抑制作用[23]，对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌等都有抑制能力。而本试验仅证明了Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7对大腸埃希氏菌（血清型O111）、金黄色葡萄球菌表现出较强的抑制能力，因此后续还应对更多菌种进行抑菌试验。

4.2 药敏试验

至关重要的是，益生菌须满足不具有耐药性这一特性，以确保食用安全性。试验结果表明，牦牛源枯草芽孢杆菌不具有耐药性，不存在携带或转移耐药基因的风险。研究表明，在使用益生枯草芽孢杆菌时，不应与其敏感的抗生素一起使用，这是保证益生菌起作用的关键。

4.3 牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒的家兔的治疗作用

动物性试验的牦牛源枯草芽孢杆菌使用剂量是根据枯草芽孢杆菌对大肠杆菌O111攻毒的家兔治疗使用剂量的试验而定。治疗剂量为20 mL/头，1次/d，持续给药7 d。关于牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）攻毒家兔细菌性腹泻的治疗作用，笔者仅进行了每天给药1次的治疗试验，而没有做每天给药2次和3次的试验，每天给药2次和3次的治疗率将大于每天给药1次的治疗率。综上，牦牛源枯草芽孢杆菌具有治疗被大肠埃希氏菌感染的细菌性肠道疾病的作用。试验期间未发现不良反应。

由组织石蜡切片可看出，大肠埃希氏菌对动物肠道造成了不同程度的破坏，回肠和结肠组织破坏程度最严重，十二指肠、空肠、盲肠次之，直肠变化不明显。该试验攻毒是采用腹腔注射的方法，若采用灌服的方法，组织变化是否会有所不同，还需进一步研究探讨。

试验组家兔肠道病理变化较对照组肠道病理变化均大幅改善。对照组肠道破坏程度较大，微绒毛萎缩，刷状缘损伤，上皮细胞排列混乱。具体表现为肠黏膜水肿、萎缩，严重的甚至坏死，细胞排列紊乱，肠壁脱落明显，细胞间的连接结构变形。试验组经牦牛源枯草芽孢杆菌Yak-KC7治疗，绒毛水肿现象、黏膜病理变化明显减轻，绒毛高度明显增加，排列更紧凑整齐，上皮细胞无脱落现象。

5 结论

本试验结果表明，4株牦牛源枯草芽孢杆菌Yak-KC1、Yak-KC5、Yak-KC6、Yak-KC7对大肠埃希氏菌（血清型O111）、金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用，Yak-KC7对大肠埃希氏菌（血清型O111）、金黄色葡萄球菌的抑制作用最佳。动物性试验证明，牦牛源枯草芽孢杆菌对被大肠埃希氏菌（血清型O111）感染的家兔肠道有良好的治疗效果，且该菌安全无毒，不具有耐药性。综上，牦牛源枯草芽孢杆菌具有益生作用，有作为益生菌株的潜能，为西藏地区益生菌种提供了参考。

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