川牛膝多糖联合维生素C体外抑制HepG-2肿瘤细胞活性的作用

郝婧玮 张 蕾 秦金玲

摘要：为了解川牛膝多糖联合维生素C抑制肿瘤细胞活性作用，采用超声波提取法从川牛膝根中提取川牛膝多糖（RCP），经Sevage法除去蛋白，并采用30%双氧水脱色、浓缩、冻干，得到川牛膝粉针剂，通过苯酚硫酸法制作葡萄糖标准曲线，进而测得多糖含量。体外联合维生素C作用于肝癌HepG-2细胞，采用噻唑蓝（MTT）法研究对 HepG-2 细胞的抑制作用。结果表明，川牛膝多糖与维生素C均可抑制肝癌HepG-2细胞的增殖，当多糖质量浓度为5、50、100、200 mg/mL时，对肝癌HepG-2的抑制率分别为19.7%、62.1%、59.1%、65.1%。当维生素C的浓度为0.1、02、0.3、0.4 mmol/L时，对肝癌HepG-2的抑制率为10%、11%、12%、54%。研究结果提示两者对肿瘤的抑制均呈剂量依赖性，当两者联合用药时，两者呈协同增效抗肿瘤作用，随着两者浓度的增加抑制率逐渐增強，对HepG-2细胞的最大抑制率可达84.2%。

关键词：川牛膝多糖;维生素C;肝癌;HepG-2细胞

中图分类号： R735.7;R285.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0192-04

收稿日期：2019-05-17

基金项目：黑龙江省教育厅项目（编号：1353MSYQN009）;黑龙江省牡丹江市科学技术计划（编号：Z2018s074）;黑龙江省大学生创新创业训练计划（编号：201810233031）。

作者简介：郝婧玮（1985—），女，辽宁宽甸人，硕士，讲师，主要从事肿瘤药理学研究。Tel：（0453）6511042;E-mail：swxhjw@126.com。  牛膝为苋科多年生草本植物，主要分为怀牛膝（Achyrnthes bidentata）和川牛膝（Cyathula capitata）2种。《中华人民共和国药典（2015年版）》上记载，牛膝有补肝肾、强筋骨、逐痕通经、引血下行之功效[1]。川牛膝主产于四川省、贵州省、云南省、福建等地，具有活血、利尿、降血糖、保肝、增强机体免疫力等功效。近年来，对川牛膝的抗肿瘤研究较多，其多糖成分[3] CoPS1、CoPS2、CoPS3被认为是其主要活性成分并具有抗肿瘤作用[4]。陈红等人观察了川牛膝多糖对小鼠肉瘤、小鼠肝癌的抑制作用及对环磷酰胺（Cy）所致正常及荷瘤小鼠外周白细胞减少的影响[5]，表明川牛膝多糖对小鼠肝癌（S180）的抑制率为21.99%～42.21%;对环磷酰胺（Cy）所致正常或荷瘤小鼠外周血白细胞减少有极显著的回升作用，说明川牛膝多糖不仅有抗肿瘤作用，还能减轻Cy所致外周白细胞减少。宋军等对川牛膝多糖对小鼠肝癌细胞H22抑制作用研究表明，Cy对肝癌细胞H22（腹水型）有强烈的抑制作用[6]。川牛膝多糖对小鼠肝癌细胞H22（腹水型）有一定的抑制作用，其抑瘤作用及机理有待进一步研究。

作为生物体内普遍存在的一类生物大分子，来源于中药的多糖[7-9]已超过200种，诸多研究表明多糖具有促进机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、降血脂等生物活性，目前在临床上已用于治疗肝炎、艾滋病、癌症和许多其他疾病[10-15]。有研究发现，维生素C不仅可以保护细胞，还可以抑制和杀伤肿瘤细胞，维生素C有抗胃癌、宫颈癌[16-17]作用。本研究以川牛膝根中提取的川牛膝多糖（RCP），在体外联合维生素C作用于肝癌HepG-2细胞，研究对HepG-2细胞的抑制作用，旨在探讨川牛膝多糖抗肿瘤作用机制，为抗肿瘤药物机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细胞株与试剂 细胞株，人肝癌HepG-2，由哈尔滨工业大学传代保种。川牛膝，产地为四川。维生素C，天津市永大化学试剂有限公司;胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司;PBS冲液，瑞楚生物;胰蛋白酶-EDTA溶液，源叶生物;DMSO，岳阳湘茂医药化工有限公司;DMEM培养基，美国Gibco公司。

1.1.2 主要仪器 超声波清洗机（SB-5200DT），购于宁波新芝生物科技有限公司;冷冻干燥机（FD-1），购于北京博医康技术公司;旋片真空泵（2XZ-2），浙江黄岩求精真空泵厂制造;电热恒温水浴锅（HWS28），购于上海一恒科技有限公司;超级恒温水浴（HH-601），购于江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;手提式压力蒸汽灭菌器（XFS-280），购于浙江新丰医疗器械有限公司;电热鼓风干燥箱（DHG-9055A），购于上海一恒科学技术有限公司;循环水真空泵（SHZ-D3），购于巩义市予华仪器有限责任公司;生物安全柜（BHC-1300IIA2），购于蓟州净化;超低温冰箱（U410-86），购于Peppercorn公司;紫外分光光度计（722N），购于北京普析通用仪器有限公司;电子天平（BSA224S-CW），购于赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;Synergy HTX（SILFTA），购于美国伯腾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牛膝多糖粗提取物的提取 称取川牛膝粉末500 g，按料液比1 g ∶ 13 mL加入蒸馏水浸泡 1.5 h，60 ℃ 超声提取2 h，过滤、弃滤渣，合并提取液。90 ℃ 浓缩，待浓缩液呈黏稠状，冷却，按照浓缩液与乙醇比1 ∶ 9的体积比加入无水乙醇，搅拌均匀，静置过夜。弃上清、取沉淀、洗涤，即为川牛膝多糖粗提取物。将多糖粗提取物加适量蒸馏水使其溶解，得多糖粗提取液。

1.2.2 牛膝多糖粗提取物的精制与冻干 按5 ∶ 1（多糖粗提取液∶ 30%过氧化氢）体积比加30%过氧化氢脱色素，温度控制在50 ℃，脱色2～4 h，期间用氨水调pH值保持在8.0左右。重复处理5次后，溶液由橙黄变为近透明状，视为脱色完成。按Sevage试剂与多糖粗提取液以1 ∶ 3的体积比于分液漏斗中萃取3次，分离上层多糖提取物。将处理后的多糖置于50 ℃恒温水浴锅中水浴、浓缩，将浓缩液倒在若干培养皿中，使溶液铺满皿底薄薄一层，放在 -80 ℃ 冰箱中预冻24 h，取出放置冷冻干燥机中-200 ℃，8 h冻干，密封冷藏，备用。

1.2.3 苯酚硫酸法制定葡萄糖标准曲线 称取01 g葡萄糖，倍比稀释得100 μg/mL的葡萄糖溶液。称取5 g苯酚，置100 mL容量瓶中定容，制得5%苯酚溶液，避光保存。分别取9支25 mL干燥的具塞比色管，编号依次为0～8号，0号作空白组校正，1～8 号分别加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、16、1.8 mL葡萄糖溶液，再加蒸馏水补至2 mL，后加入0.8 mL 5%苯酚试液、5 mL 98%浓硫酸，充分振荡，蒸馏水补至9 mL。100 ℃沸水浴15 min，冷却，490 nm处测吸光度。

1.2.4 标准曲线精密度测定 称取0.1 g葡萄糖，定容至50 mL，制成2 mg/mL葡萄糖样液，精确吸取250 μL样液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，得10 μg/mL的葡萄糖供试液。取5支具塞试管，编号依次为0～4号，0号为空白组，1～4号为试验组，每組分别吸取1 mL葡萄糖供试液，按照标准曲线法测得每组葡萄糖的吸光度，求RSD值。

1.2.5 川牛膝冻干粉多糖百分含量测定 称取川牛膝多糖冻干粉0.1 g，配制成0.06 mg/mL 川牛膝多糖供试液。按照标准曲线法测量川牛膝多糖在490 nm处的吸光度，带入标准曲线方程得到川牛膝多糖相当于葡萄糖的浓度，根据公式（1）得出川牛膝多糖的百分含量：

式中：A为川牛膝多糖的百分含量，%;C为川牛膝多糖相对于葡萄糖的浓度（μg/mL）;D为稀释倍数;m为称取干燥恒质量的川牛膝冻干粉的质量（mg）。

1.2.6 细胞的复苏与传代 取出冻存细胞，融化，采用DMEM洗去冻存液。转移至含有0.5 mL 10%胎牛血清、3.5 mL DMEM的培养皿中，放入CO2恒温培养箱，24 h后观察细胞生长状况并更换培养液。当细胞铺满皿底时，开始传代。弃去细胞培养皿中的培养液，加适量胰酶，37 ℃消化1 min，加适量血清，终止胰酶消化反应。离心、弃上清，加2 mL DMEM吹打均匀。各吸取1 mL细胞液分别置于含0.5 mL胎牛血清和3.5 mL DMEM的培养皿中，轻轻振荡，混匀，于倒置显微镜观察。放入CO2恒温培养箱中，24 h后观察细胞生长状况。

1.2.7 不同浓度牛膝多糖作用于HepG-2肿瘤细胞 取对数期细胞悬液，置96孔板中，每孔80 μL，于CO2恒温培养箱中孵育，过夜，使细胞铺满孔底。分别取0.025、0.250、0.500、1.000 g川牛膝多糖，溶于1 mL DMEM中配制成0.025、0.250、0.500、1.000 g/mL 的多糖培养液，每个质量浓度梯度设2个复孔，以不加多糖的细胞作空白对照。在每孔中加入20 μL不同质量浓度梯度的多糖培养液，孵育24 h，倒置显微镜观察。每孔加入20 μL MTT，注意遮光，放培养箱培养4 h，终止培养，弃去多糖培养液。 每孔加100 μL二甲基亚砜，振摇10 min，用酶标仪在 490 nm 下测量吸光度。

1.2.8 不同浓度维生素C作用于HepG-2肿瘤细胞 分别取0.02、0.04、0.05、0.07 g维生素C溶于1 mL培养基中，配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的维生素C液，每个浓度梯度设2个复孔，以不加药孔作为空白孔。其他步骤同“1.2.7”节。

1.2.9 不同质量浓度川牛膝多糖联合不同浓度维生素C作用于HepG-2肿瘤细胞 将维生素C（01、0.2、0.3、0.4 mmol/L）和多糖（0.025、0.250、0.500、1.00 g/mL）按不同浓度或质量浓度梯度从小到大联合用药，每组设2个复孔。以细胞原液作空白孔，其他步骤同“1.2.7”节。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线与川牛膝多糖含量的测定

葡萄糖在吸收光490 nm所得的曲线回归方程为y=0.009x+0.1 256，r2=0.932 2。葡萄糖质量浓度在20～90 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。精密度RSD=2.6%<5%，说明试验精密度良好。计算得川牛膝的百分含量为64.8%，其中C=38.93 μg/mL，D=1 666.7，m=100 mg。

由表1可知，将0.06 mg/mL川牛膝多糖供试液设2平行对照组于490 nm处，测得吸光度值，代入葡萄糖标准曲线得到川牛膝多糖相对于葡萄糖的含量为64.8%。试验采用的是超声波辅助提取法，收率高于浸渍法。

2.2 川牛膝多糖对HepG-2肿瘤细胞活性的抑制

由图2可知，川牛膝多糖（RCP）体外有很好的抗肿瘤活性，在川牛膝多糖（RCP）体外作用于HepG-2细胞24 h内，抗肿瘤效果呈剂量依赖性，随着剂量增高抑制率也随之增高。川牛膝多糖（RCP）质量浓度这50 mg/mL时，抑制率达到621%，随后再增加川牛膝多糖（RCP）的质量浓度，抑制率增加幅度变小。当多糖质量浓度为100 mg/mL时，抑制率为591%，接近50%，可将100 mg/mL川牛膝多糖作为细胞的半数抑制浓度（IC50）。川牛膝多糖质量浓度为200 mg/mL时，抑制率达到651%，为最大抑制率。

2.3 维生素C对HepG-2肿瘤细胞活性的抑制

维生素C体外也有抗肿瘤活性，24 h内，随着维生素C浓度的增高，抑制率也呈上升趋势，抗肿瘤活性呈剂量依赖性。维生素C浓度为0.4 mmol/L时，抑制率为54%（图3），接近50%，可将0.4 mmol/L维生素C看作半数抑制浓度（IC50）。

2.4 川牛膝多糖联合维生素C对HepG-2肿瘤细胞活性的抑制

由图4可知，不同质量浓度或浓度组合的川牛膝多糖（5、50、100、200 mg/mL）与维生素C（0.1、02、0.3、0.4 mmol/L）联合作用于HepG-2细胞 24 h，MTT法检测并计算出对细胞的的抑制率，结果呈现剂量依赖性，当川牛膝多糖浓度固定时，随着维生素C浓度的上升，抑制率逐渐升高。200 mg/mL的川牛膝多糖与维生素C的联合抗肿瘤活性是所有组合中的最佳组合。当维生素C浓度为0.4 mmol/L，多糖质量浓度为200 mg/mL，抑制率达到最大值84.2%。0.2 mmol/L维生素C与不同质量浓度多糖联合对细胞的抑制率均很接近。

3 讨论

3.1 苯酚硫酸法测定条件因子选择

苯酚硫酸法测多糖含量的原理为多糖在硫酸作用下水解成单糖，再与苯酚结合在吸收光为 490 nm 处的最大吸收值。由于不同多糖的组成不同，苯酚硫酸法采用的苯酚用量、浓硫酸用量也不尽相同。通过对川牛膝多糖苯酚硫酸法测定条件因子水平研究，本研究选择为5%苯酚0.8 mL、98%浓硫酸5 mL。

3.2 多糖冻干喷瓶现象

在做多糖冻干粉时，出现喷瓶现象，可能是由于多糖的预冻不完全，冷冻干燥机升温过快导致试品部分液化，易在真空减压条件下出现喷瓶现象。也可能由于多糖浓缩液中有机试剂残留过多，导致喷瓶。处理的方法为增加多糖预冻时间，控制冷冻干燥机升温速度，提高多糖浓缩温度，减少浓缩液体积，必要时进行旋蒸去除多糖中残留的有机试剂。

3.3 多糖及维生素C体外抑制HepG-2肿瘤细胞活性

肝癌是严重危害人类健康的病症之一，死亡率极高，目前化学药物在市场上占据主导地位。但是化学药物对人体危害极大，耐药性产生概率极高，且單一用药难以控制病情发展[18-20]。研究天然活性成分的抗肿瘤作用是科学领域的一个热门话题。试验根据MTT法测得川牛膝多糖、维生素C单独作用及两者不同浓度联合的体外抗肿瘤活性，证明了川牛膝体外的抗肿瘤活性。早有研究表明维生素C有助于预防胃癌、宫颈癌，对肝癌的研究鲜有研究。本试验证明维生素C在体外对Hep-2肝癌细胞的抗肿瘤活性，维生素C抗肿瘤活性比较低，可能与配制浓度太小有关，也可能是因为配制维生素C溶液时，未及时采取遮光措施导致维生素C分解，药效减弱。两者联用时，总体效果比单独抗肿瘤活性高，说明两者体外抗肿瘤具有协同作用。可能是由于维生素C影响Hep-2肝癌细胞HIF的表达和川牛膝多糖的抗肿瘤作用共同诱导细胞发生凋亡。

4 结论

研究发现，川牛膝多糖、维生素C、川牛膝多糖联合维生素C均能抑制肝癌HepG-2细胞增殖活性，联合用药抑制率比两者单用要大。药物作用细胞的24 h内，当多糖质量浓度为5、50、100、200 mg/mL 时，对细胞的抑制率分别为19.7%、621%、591%、65.1%。当维生素C的浓度为01、0.2、03、0.4 mmol/L时，对肝癌HepG-2细胞的抑制率为10%、11%、12%、54%，说明两者对肿瘤的抑制均呈剂量依赖性，且川牛膝多糖在低质量浓度时抗肿瘤活性就较大。维生素C在低浓度时抗肿瘤活性小，高浓度时明显增加。两者联合用药对肝癌HepG-2的抑制率最高可达84.2%。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]韩大鹏，石关桐. 蔺道人《仙授理伤续断秘方》浅析[J]. 上海中医药杂志，2007，41（2）：55-56.

[3]Zhou R，Bo-Gang L I，Zhang G L . Glycosides from roots of cyathula officinalis kuan[J]. 2005，47（3）：368-374.

[4]丁杰龙. 川牛膝多糖的抗肿瘤作用初探[J]. 中国民族民间医药，2009，18（13）：46-47，115.

[5]陈 红，刘友平. 川牛膝多糖抗肿瘤作用初探[J]. 成都中医药大学学报，2001，24（1）：49-50.

[6]宋 军，杨金蓉，李祖伦，等. 川牛膝多糖对小鼠肝癌细胞H22抑制作用研究[J]. 中药药理与临床，2001（3）：19.

[7]吕晓英，马东瑞，李 由，等. 红毛五加多糖对体外人胃癌细胞基因及细胞因子表达的影响[J]. 实用肿瘤杂志，2001（1）：45-46.

[8]邹 翔，孙 宇，王宏亮. 芦荟多糖对荷瘤小鼠肿瘤细胞膜功能的影响[J]. 哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2005，21（1）：11-13，5.

[9]季宇彬，高世勇，张秀娟. 羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J]. 中国中药杂志，2004，29（3）：245-247.

[10]陶 喆，程建明. 中药多糖抗肿瘤机制探讨[J]. 江苏中医药，2003，24（6）：47-49.

[11]郑 敏. 中药多糖抗肿瘤的药理学研究进展[J]. 国外医学（中医中药分册），2000，22（5）：259-263.

[12]郑应馨，徐恒卫. 具有抗肿瘤活性的多糖及其作用机理研究概况[J]. 中国药师，2003（6）：368-369，372.

[13]黄 芳，蒙义文. 活性多糖的研究进展[J]. 天然产物研究与开发，1999（5）：90-98.

[14]张忠玲，朱 波，张 翠，等. 海胆肠多糖致Bel7402人肝癌细胞凋亡的扫描电镜观察[J]. 电子显微学报，2003，22（6）：467.

[15]Wang B J，Won S J，Yu Z R，et al. Free radical scavenging and apoptotic effects of cordyceps sinensis fractionated by supercritical carbon dioxide[J]. Food and Chemical Toxicology，2005，43（4）：543-552.

[16]王新保，秦 双，张迎黎. 维生素C对体外胃癌细胞的影响[J]. 新乡医学院学报，1998，15（4）：33- 35.

[17]李 能，周 波，陈忠东. 维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响[J]. 南华大学学报（医学版），2004，32（2）：161-163.

[18]Germano S，ODriscoll L. Breast cancer：understanding sensitivity and resistance to chemotherapy and targeted therapies to aid in personalised medicine[J]. Current Cancer Drug Targets，2009，9（3）：398-418.

[19]Zhao Q Z，Dou K F. Methylation of ras association domain family protein 1，isoform a correlated with proliferation and drug resistance in hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology，2007，22（5）：683-689.

[20]Porta L，Caterina. Mechanism of drug sensitivity and resistance in melanoma[J]. Current Cancer Drug Targets，2009，9（3）：391-397.贾文婷，杨 慧，吴洪斌，等. 红枣变温压差膨化产品品质评价体系的研究[J]. 江苏农业科学，2020，48（11）：196-201.