基于BMP-Smad/RUNX2信号通路探讨固本增骨方含药血清对大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影响＊

宋 敏，巩彦龙，董 平，2，董万涛，蒋林博

（1. 甘肃中医药大学 兰州 730000；2. 内蒙古医科大学 呼和浩特 010110；3. 甘肃中医药大学附属医院 兰州730020；4. 深圳市罗湖区中医院 深圳 518000）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的终末分化细胞是成骨细胞（Osteoblasts，OB），现有的研究已知OB 和破骨细胞（Osteoclast，OC）之间的动态平衡，在维持骨微结构和骨内稳态方面具有关键作用[1]，这些细胞参与多种骨病尤其是骨质疏松症（Osteoporosis，OP）的病理生理过程。随着年龄的不断增加，性激素缺乏等多种因素造成OB 与OC 间动态平衡关系被破坏，表现为骨破坏增加而骨形成减少，这在老年女性中最常见，但男性也有较高的风险[2]。

虽然OP 被认为是老化的预测结果，但它是可以避免和可治疗的。在过去的几十年中，主要是通过应用双膦酸盐阻止骨吸收，近年来，更多研究的注意力集中在通过促进骨形成方法来治疗OP，现有治疗OP的西药主要包括抗骨吸收和促进骨合成的作用，尽管这些药物在防治OP 的机制中有一定的改进，但是由于担心抗再吸收药物的异常副作用，以及缺乏对维持其长期有效性的确认，导致许多患者不易接受这些药物[3]。而中医药通过对机体的整体调节防治OP，疗效显著、副作用小，对OP 的防治有积极作用。近年，基于诱导BMSCs 向成骨细胞分化治疗OP 已成为治疗骨质疏松症的一种方法[4]。本实验研究通过体外建立大鼠BMSCs 定向诱导向OB 分化的模型，运用固本增骨方含药血清进行干预，观察固本增骨方对大鼠BMSCs增殖及成骨分化过程的影响并探讨其可能的机制。

1 材料

1.1 动物与细胞

3月龄SPF 级Wistar 大鼠30 只，雌雄各半，体重（200±20）g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，在SPF级动物实验室饲养，光线昼夜交替各12 h，实验室温度：（22 ± 2）℃，湿度：（55 ± 5）%，给予实验室专用纯净水及饲料喂养，每2天更换垫料1次。Wistar大鼠BMSCs（广州赛业生物科技有限公司提供，货号：RAWMX-01001）。

1.2 药品与试剂

固本增骨方主要成分：炙黄芪、岷当归、烫狗脊等，由甘肃中医药大学附属医院药剂科提供。将上方煎煮、浓缩后制成粉末，生理盐水配制成25 g·L-1混悬液。BMSCs 完全培养基、BMSCs 成骨诱导分化完全培养基、0.1% 明胶（RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001），广州赛业生物科技有限公司；碱性磷酸酶染液（T170512G001），广州赛业生物科技有限公司提供；BGP ELISA 试剂盒（MM-0700R2）、COL-I ELISA 试 剂 盒（MM-0665R2）、OPN ELISA 试 剂 盒（MM-0701R2）、ALP ELISA 试剂盒（MM-0217R2），酶免公司提供。RIZOI 试剂（94206），美国ambion 公司；逆转录、荧光定量试剂盒（0000238439）美国Promega公司；PCR 引物（CHPQ332），大连宝生物工程有限公司。

1.3 仪器

二氧化碳培养箱（MCO-18AIC[UV]），日本SANYO公司；低温高速离心机（D37520），美国Kendro 公司；PCR荧光定量仪（C1000），美国BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 固本增骨方含药血清的制备

大鼠适应性喂养1 周后，随机分为2 组，空白血清组10 只、含药血清组20 只。依据人与大鼠“体表面积换算法”，按临床等效剂量给药，含药血清组按照10 ml·kg-1固本增骨方混悬液灌胃，空白血清组给予相同体积生理盐水。连续给药7 天，早晚各1 次。末次给药2 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏取血，3000 rpm离心15 min取血清，过滤除菌后，-20℃保存备用。

2.2 Wistar大鼠BMSCs的培养

复苏BMSCs，将其用0.25%胰蛋白酶、0.04%EDTA 消化液在37℃消化2 min 左右后，吸取细胞悬液至离心管，离心机设置3000 rpm 离心5 min，去掉上清，加入培养基重悬。台盼蓝染色行活细胞计数，以3.0 × 104个活细胞/cm2密度将细胞接种分瓶后置入37℃、5% CO2培养箱中继续传代培养，最终培养出符合实验要求的BMSCs。

2.3 分组与造模

挑选长势优良的P3 代BMSCs，随机分为6 组：依次为空白血清组，传统成骨诱导组，5%含药血清组、10%含药血清组、20%含药血清组、30%含药血清组。将P3 代BMSCs 分别接种于5 块96 孔培养板，每孔依次加入200 ul BMSCs 完全培养基，每组5孔，后置于饱和湿度培养箱培养24 小时，并吸弃掉各孔培养基，按实验分组依次向5 块培养板加入空白血清、传统成骨诱导培养基（含体积分数10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素和100 mg·ml-1链霉素、抗环血酸50 mg·L-1，β-甘油 磷 酸 钠10 mmol·L-1、地 塞 米 松10-7mol·L-1的LDMEM 培养基）[5]、（5%、10%、20%、30%）含药血清继续培养。24 h 后对各组细胞测量计数，每天检测1 块培养板，连续5天。

2.4 大鼠BMSCs增殖的检测

向上述各组加入相应培养液，24 小时后测量6 组细胞计数，每天测一块96 孔板，连续检测4 天。向孔板每孔内加入MTT及培养液，置37%培养箱继续培养4 h，后吸去培养液，加入DMSO 甘氨酸缓冲液，摇床振荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测量OD值，依次测定各组细胞的相对增殖率。

图1 P1、P2、P3代BMSCs镜下形态×10

表1 组间OD值比较（±s）

表1 组间OD值比较（±s）

注：与空白组比较▲P＞0.05，与空白组及传统成骨诱导组比较ΔP＜0.05，与传统成骨诱导组比较■P＜0.05，与5%、10%及30%含药血清组□P＜0.05。

120hOD值0.394±0.051Δ■0.459±0.228Δ■0.667±0.054Δ■□0.541±0.062Δ■0.435±0.0460.473±0.022Δ组别5%含药血清组10%含药血清组20%含药血清组30%含药血清组空白组传统成骨诱导组24hOD值0.078±0.001Δ 0.103±0.012Δ 0.108±0.035Δ 0.106±0.004Δ 0.074±0.0010.072±0.002▲48hOD值0.093±0.011Δ■0.273±0.054Δ■0.362±0.013Δ■□0.202±0.012Δ■0.067±0.0110.090±0.012Δ 72hOD值0.426±0.050Δ■0.453±0.026Δ■0.612±0.123Δ■□0.419±0.114Δ■0.363±0.0720.414±0.107Δ 96hOD值0.479±0.041Δ■0.506±0.043Δ■0.705±0.163Δ■□0.546±0.091Δ■0.466±0.0230.476±0.061Δ

2.5 碱性磷酸酶染色

成骨诱导2周后，吸弃培养基，4%中性甲醛固定，按碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行染色、固定，光镜下观察各组细胞蓝紫色区域的密集程度。

2.6 BMSCs成骨标志蛋白的检测

分别取空白对照组、传统诱导组、固本增骨含药血清（5%、10%、20%、30%）组1 × 106BMSCs，在4℃用PBS 洗涤细胞3 次，加入的RIPA 裂解液（含1%PMSF），于冰上裂解30分钟，后收集细胞裂解物，设置12000 rpm、离心10 分钟，吸取上清液。按ELISA 试剂盒说明书步骤，检测一型胶原蛋白（COL-I）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（BGP）、骨桥蛋白（OPN）四种蛋白OD 值，根据标准品浓度及所对应OD 值，绘制每组蛋四种蛋白的标准曲线（R＞0.99），后根据函数式计算各组四种蛋白的浓度，并进行统计分析。

2.7 BMPs信号通路相关基因的检测

取空白对照血清组、（5%、10%、20%、30%）浓度含药血清，培养7 天，采用trizol 法提取总RNA，核酸蛋白仪检测总RNA 的浓度及纯度，按照逆转录试剂盒说明书操作。设计引物及反应体系。后在RT-PCR仪上进行反应。检测样本的中BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2的CT值。根据各组样本CT值与2-ΔΔCT值，进行统计分析。

2.8 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数加减标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析法，LSD 方法进行多组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 BMSCs培养结果

BMSCs P1 代培养1 天后，镜下观察可见细胞呈圆形且折光性强；培养5 天小时后，见形态呈条柱状、分叉状贴壁生长；P2、P3 代培养5 天后见细胞增殖分裂加快，逐渐呈纤维细胞长梭状形态，结果见图1。

3.2 各组BMSCs的增殖

在最初24 h 传统成骨诱导组与空白组OD 值比较差异无统计学意义（P＞0.05），但各含药血清组与传统成骨诱导组及空白组OD 值比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；后面四个时间点各药物组OD 值与空白组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；各含药血清组与空白组及传统成骨诱导组（何为传统成骨诱导？）OD 值比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），且20%含药血清组与5%、10%及30%含药血清组OD 值比较差异具有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

3.3 各组细胞碱性磷酸酶染色结果比较

碱性磷酸酶染色后镜下观察可见各浓度固本增骨胶囊含药血清组及传统诱导组细胞呈现蓝紫色染色阳性区，且蓝紫色染色阳性区随含药血清浓度增加染色区域逐渐密集，在浓度为20%时染色区域最密集，当浓度为30%时，染色区域减少，结果见图2。

图2 各组细胞碱性磷酸酶染色结果100×

3.4 各组BMSCs 成骨标志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I含量

5%、10%、20%含药血清组与其他各组比较，BGP、OPN、ALP、COL-I四种成骨标志蛋白含量具有明显差异（P＜0.05），其中20%含药血清组与5%、10%含药血清组之间差异具有统计学意义（P＜0.05），而30%含药血清组与空白组及传统成骨诱导组比较，四种成骨标志蛋白含量无明显差异（P＞0.05），传统成骨诱导组与空白组四种成骨标志蛋白含量比较无明显差异（P＞0.05），结果见表2。

表2 各组BMSCs成骨标志蛋白含量比较（±s，μg/L）

表2 各组BMSCs成骨标志蛋白含量比较（±s，μg/L）

注：与30%含药血清组、空白组及传统成骨诱导组比较▲P＜0.05，与5%、10%含药血清组ΔP＜0.05，与空白组及传统成骨诱导组比较■P＞0.05，与空白组比较P＞0.05。

COL-I 15.934±3.544▲21.38±3.627▲25.34±5.239▲Δ 6.479±1.253■6.097±0.8956.448±1.002□组别5%含药血清组10%含药血清组20%含药血清组30%含药血清组空白组传统成骨诱导组BGP 7.493±1.986▲7.992±1.91▲9.509±2.393▲Δ 1.405±0.328■1.468±0.2701.611±0.389□OPN 16.551±3.094▲18.405±2.149▲21.773±8.064▲Δ 1.648±0.725■1.645±0.2771.778±0.322□ALP 22.829±1.472▲26.63±4.652▲27.804±4.358▲Δ 6.266±0.133■6.145±0.0336.186±0.101□

3.5 各组细胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表达比较

20%含药血清组与其他各组蛋白表达比较有显著差异（P＜0.05），5%、10%及30%含药血清组与空白组及传统成骨诱导蛋白表达比较无明显差异（P＞0.05），传统成骨诱导组与空白组蛋白表达比较无明显差异（P＞0.05），结果见表3。

4 讨论

OP是一种多因素疾病，其表现为骨量减少和骨微结构变化，导致典型的低能量脆性骨折发生率增加[6]。人口老龄化对OP 的发生和进展具有巨大的影响，这在绝经后妇女中更为明显，其中骨转换的比例随着雌激素的缺乏而增加，并导致持续的骨损伤[7]。据统计全世界有2 亿多人患有骨质疏松症，50 岁以上的女性中近1/2 和男性中近1/5 可能发生骨折[8]。治疗OP 的目的是减少骨丢失，维持骨密度，新疗法如基于BMSCs 高成骨分化能力为基础的治疗，能通过增加患者缺失的矿物质密度和驻留BMSCs 的数量及其功能返回[9]，可运用不同方式诱导BMSCs 向成骨增殖和分化，BMSCs 向成骨细胞的生成和对破骨细胞的抑制可减少骨密度损失[10]，阻止骨质疏松，进而降低OP 骨折发生率。已有的研究显示[11]将异基因BMSCs 注射在去卵巢OP 大鼠模型或糖皮质激素诱导OP 大鼠模型中，都能刺激OB 的发生和连续持续的骨形成，而改变了骨量和骨强度，这是不同因素的作用诱导BMSCs 向OB 分化和BMSCs 的作用使OB 的成骨作用增强，但是如何有效的诱导BMSCs 在体内外向OB 分化并促进其成骨作用，仍然有多种不确定的因素。研究显示[12-14]，中医药可以调控基因、信号通路、细胞因子等多途径诱导BMSCs 向OB 分化并促进其成骨作用。本实验研究运用固本增骨方含药血清进行干预BMSCs 诱导其向OB 分化，观察固本增骨方对大鼠BMSCs 增殖及成骨分化过程的影响并探讨其可能的机制。

表3 各组细胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表达比较（±s）

表3 各组细胞BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA表达比较（±s）

注：与其他各组比较▲P＜0.05，与空白组及传统成骨诱导组比较ΔP＞0.05，与空白组比较■P＞0.05。

RUNX21.144±0.287Δ 1.282±0.391Δ 1.825±0.103▲1.061±0.113Δ 0.932±0.0840.968±0.119■组别5%含药血清组10%含药血清组20%含药血清组30%含药血清组空白组传统成骨诱导组BMP21.053±0.259Δ 1.171±0.264Δ 1.776±0.381▲1.015±0.152Δ 0.923±0.1280.993±0.270■BMP41.163±0.012Δ 1.252±0.014Δ 1.72±0.049▲1.009±0.021Δ 0.958±0.2200.981±0.080■Smad11.09±0.15Δ 1.32±0.19Δ 1.84±0.45▲1.017±0.09bΔ 0.94±0.010.94±0.02■

BMSCs 的增殖情况来看，各组固本增骨方含药血清组在培养24小时后比空白组及传统成骨诱导组OD值比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明且固本增骨方含药血清能促进BMSCs增殖，并且在20%含药血清组较5%、10%及30%含药血清组OD 值比较差异具有统计学意义（P＜0.05），说明20%含药血清对BMSCs 增殖最具促进作用，碱性磷酸酶染色后镜下观察细胞增殖情况，也印证了这一结果，可见蓝紫色阳性区随含药血清浓度增加染色而逐渐逐渐密集，在浓度为20%时染色区域最密集，当浓度为30%时，染色区域减少。BGP、OPN、ALP、COL-I 是成骨标志蛋白，非胶原蛋白BGP 是骨形成的特异性标志物，其能够抑制异常的羟磷灰石结晶的形成及软骨的矿化速率，进而维持骨量、参与骨重塑[15]；ALP 在诱导BMSCs 向OB分化及维持骨代谢平衡过程中具有重要的意义[16]；OPN 可能是影响绝经后妇女腰椎骨量丢失的关键因子[17]；COL-I 的结果、含量及稳定性改变，与OP 的发生关系密切[18]；本实验结果显示，5%、10%、20%含药血清组与其他各组BGP、OPN、ALP、COL-I 含量比较有统计学意义（P＜0.05），且20%含药血清组与5%、10%含药血清组比较有统计学意义（P＜0.05），说明20%含药血清组最具有促进BMSCs 成骨的作用。BMPSmad信号通路在成骨细胞增殖、迁移及促进骨形成过程中起着关键作用，其与OP 的发生、发展关系密切，Smad 参与了BMP（包括BMP2、BMP4）对RUNX2 表达的上调，研究显示，原硅酸诱导BMSCs 向成骨细胞分化及成骨过程中，BMP-Smad/RUNX2信号通路的活化促进BGP、OPN、COL-I 的合成[19]，本实验结果显示，20%含药血清组与其他各组BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA 表达比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明20% 含药血清组能促进BMSCs 成骨BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2 mRNA的表达。

目前西医对OP 的治疗通过抑制骨吸收和促进骨形成，这些西药又有不同程度的不良反应、患者依从性差等。固本增骨方是甘肃中医药大学宋敏教授经验方，由道地中药材炙黄芪、岷当归、烫狗脊等组成，治疗OP 以整体观念、辨证论治为原则，具有服用方便，疗效稳定，副作用小等优点，具有益气健脾、补肾壮骨、活血通络之功效，标本兼顾，能有效缓解老年脾肾两虚型骨质疏松症状[20-21]。本实验研究结果显示，固本增骨方能促进BMSCs 的增殖，并且能促进成骨标志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I 蛋白含量的增加，这个机制可能是激活了BMP-Smad/RUNX2 信号通路实现的。