基于仿生识别系统对金银花颜色与“气”的鉴别研究＊

姚月保，杨晓芸，彭 莲，俞越童，邵远洋，邹慧琴，闫永红

（1. 北京中医药大学中药学院 北京 102488；2. 昆药集团股份有限公司研究院 昆明 650106；3. 中山大学附属第三医院药剂科 广州 510630）

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]，有悠久的药用历史，有清热解毒，疏散风热的功效[2]，常用于治疗喉痹，丹毒[3]。现代研究表明，金银花具有提高免疫力、解热、抗炎等功效[3]。

每种中药材都有自己特定的颜色、气味，和其所含的化学成分相关，在长期用药实践中，一直把颜色和气味作为评价中药材质量的重要标准之一[1]。对上等药材的性状鉴别中，常常包括颜色和气味的语言描述，例如金银花以表面绿色[4-6]，香气浓者为佳。药材的颜色、气味不仅由它的品种和产地决定，不正确的加工、储存方法也会使药材性状特征发生改变，失去原有的色泽和气味。因此，在传统经验鉴别的指导下，我们可通过药材性状特征，辨别出药材的品种、产地、加工方法、储藏时间和质量优劣等。然而，由于在传统的性状鉴别中，人们只是凭借视觉和嗅觉对药材的颜色、气味特征进行评定，鉴定的主观性强，使得传统经验鉴别中颜色和气味特征难以客观、准确地评价药材的质量。

随着现代仿生技术的不断发展及其与中药鉴定学科的交叉结合，色度仪、电子鼻仿生技术被迅速地运用于中药品质评价，使中药颜色、气味的表述不再是主观性、抽象化的定性描述，而是数字化、客观化的定量描述。色度仪是基于三滤色片原理，利用仪器内部的标准光源照明样本，样本选择性吸收反射光线，光电探测器检测反射光并与标准光源作比较、计算[7]。电子鼻又称仿生嗅觉系统、气味扫描仪，它是以特定的传感器和模式识别系统快速提供被测样品的整体气味信息,指示样品的隐含特征[8]，因此，能够反映中药材的“整体气味特征”，符合传统中医药“整体观”的理论思想，而且不需要对样品进行前处理，可对样品进行无损分析。

药材所含化学成分种类及含量高低与药材的颜色、气味密切相关，通过颜色、“气”的客观量化可以有效地评价中药的质量。何婉婉等[9]通过对北豆根颜色和化学成分的相关性分析，发现粉末的颜色橙红色越深，其所含的生物碱含量越多。邹慧琴等[10]引入分光测色计，确定了甘草去皮打粉的断面颜色量化方法和以直接测量为主、湿法施压剥皮测量为辅的表皮颜色量化方法，测量方法简便、可靠，测量结果显示可以如实反映药材颜色情况，为中药颜色数字化发展提供了新思路。拱健婷等[11]选取易走油中药苦杏仁为研究载体，通过色度仪、电子鼻量化样品走油前后的颜色、气味变化，为中药贮藏过程中以颜色、“气”的客观量化来评价中药质量提供新的思路与参考。黄学思等[12]通过色彩色差计和电子鼻分别对槟榔样品（生槟榔、炒槟榔、焦槟榔）的颜色、“气”进行客观量化，判别中药炮制的“火候”，以此来评价槟榔炮制品。

为了实现对中药颜色、“气”描述的客观化、规范化，本文将仿生系统技术——色度仪和电子鼻引入中药性状鉴别，以常用大宗药材金银花为研究对象，建立金银花颜色、“气”数字化分析方法，为快速、准确评价金银花质量提供依据，同时利用化学计量学方法建模分析以实现对不同储藏期、产地及处理方式金银花的快速鉴别。

1 材料仪器

1.1 材料

5 批金银花样品收集于河南、河北和山东三个主产区（河南A、河南B、河南C、河北、山东），所有样品经北京中医药大学中药资源与鉴定系闫永红教授鉴定，确定为药典所规定的忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.

药材的颜色、气味和其品种、产地密切相关，同时长时间的储藏、高温烘烤、日照等也会使药材的颜色、气味发生变化。药材储藏过久，其内部会发生氧化、酶催化等反应，高温会加速药材内部细胞活动或使细胞死亡，药材在光照下易发生氧化和分解等活动，这些均会导致药材颜色和气味发生改变[13]。因此，为得到不同颜色和气味的金银花样品进行研究，本实验对上述收集的5 批样品分别按如下方法处理：①河南A、河北、山东进行常温避光储藏，每两个月进行一次测量；②河南B 分别进行70℃烘箱加热、日光光照处理，当颜色或气味发生改变时测量；③河南C 进行日光光照处理，当颜色或气味发生改变时测量。烘箱加热的温度太低，颜色改变较慢，温度太高会将样品烤糊，因此将烘箱加热的温度定为70℃；日光光照为从8:00—17:00日光照射，温度为外界气温平均温度。

样品信息见表1。

表1 金银花样品信息

1.2 仪器

BP211D 型1/100 电子分析天平（德国赛多利斯），带有积分球及色度分析软件的U-3010 紫外可见分光光度计（日本日立公司），粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司），自制石英测色皿，α-Fox3000 电子鼻指纹分析仪（法国AlphaMos公司），药典筛。

2 方法

图1 CIE1976L*a*b*均匀色空间系统

2.1 性状鉴别

组建测评小组对所有金银花样品分别做颜色、“气”感官评价，测评小组由10位有鉴定专业知识背景的北京中医药大学资源与鉴定专业的在读研究生组成，感官评价前对测评小组成员进行一段时间的相关培训。

传统认为金银花表面绿色[4-6]，香气浓者为佳，所以将感官评价指标颜色由深到浅的文字描述定为：绿色-黄绿色-绿白色-黄白色-黄色，同一个颜色深浅分4个不同等级，“1”为最深，“4”为最浅，如“绿色1、绿色2、绿色3、绿色4”是将绿色分为了4个不同等级，“1”为最深，“4”为最浅；气味由浓到淡的文字描述定为：浓郁香气-气清香-气微。同一个气味浓淡分4个不同等级，“1”为最浓，“4”为最淡，如“浓郁香气1、浓郁香气2、浓郁香气3、浓郁香气4“是将浓郁香气分为了4个不同等级，“1”为最浓，“4”为最淡。

2.2 数字化颜色的测定

本试验采用目前使用较广泛的CIE1976L*a*b*均匀色空间系统[14]，如图1 所示，L*表示明度，值越大越偏白，反之偏黑；正负a*分别表示红绿方向；正负b*分别表示黄蓝方向；ΔE*ab = {(ΔL*)2+(Δa*)2+ (Δb*)2}1/2表示色差，通常认为其≤1时，人眼无法分辨两种颜色的差异。

2.2.1 供试品的制备

粉碎金银花样品，过4号筛。混合均匀过筛粉末，以把测色皿装满为标准，取适量的粉末装入石英测色皿中，盖上石英玻璃片，并用自封膜封口，备用。

2.2.2 色度测量条件

针对工作需要的不同，颜色测量仪器分为分光测色计和色彩色差计，生产中的色差测量常使用色彩色差计，而分光测色计因为精度比较高，常用于高精度色彩的分析，其中日立3010紫外可见分光光度计精度更高，更适合科研研究，且较适宜测量粉末类样品。因此，本实验选择日立3010紫外可见分光光度计作为颜色测量仪器。

起止波长：780-380 nm；扫描速度：600 nm·min-1；狭缝宽度：1 mm；照明光源：D65；视场选择：10 度视角。

2.2.3 色度测量方法

将标准白板分别放入日立3010 紫外可见分光光度计中积分球的参比处、样品处，按照2.2.2项下所设定的条件进行基线校正，当基线校正后取出放置于样品处的标准白板，将2.2.1中所制得的供试品放入积分球的样品处，进行测量。

2.2.4 精密度考察

选取河北的样品，按照2.2.1 方法制备样品，连续测量6 次，结果显示RSD 均＜3%，说明仪器精密度良好。

2.2.5 重现性考察

选取河北样品6 份，按照2.2.1 方法制备样品，分别进行测量，结果显示RSD 均＜3%，说明方法重现性良好。

2.3 数字化气味的测定

2.3.1 供试品的制备

粉碎金银花样品，使其通过2 号筛，混合均匀粉末。称取0.5 g 样品粉末，装入顶空瓶，并立刻压盖密封。

2.3.2 顶空样品制备条件

孵化时间：360 s，孵化时间：45℃，样品震荡速度：250 r·s-1。

2.3.3 分析条件

进样量2500 μL，注射速度2500 s，载气为空气，流速150 mL·min-1，数据采集时间120 s，数据采集周期1 s，数据采集延迟300 s，吹扫时间480 s。

3 结果与分析

3.1 性状鉴别结果

组建测评小组对金银花样品分别作颜色、“气”感官评价，建立感官描述表，见表2。

将金银花样品按不同颜色、气味归类,结果见表3。传统性状鉴别金银花以颜色发绿、浓郁香气者质量为佳，黄色、气微类质量较差，从性状描述的结果来看，在避光储藏、加热和光照的样品中，随着储藏时间的推移，样品的颜色逐渐变浅，气味逐渐变淡。光照样品中温度越高，颜色和气味变化越明显。

表2 金银花样品感官描述表

3.2 颜色数字化测量结果

按照2.2 所述对所有金银花样品进行颜色测量，每个样品重复3次，记录平均值，结果见表4。

表4 金银花颜色测量指标值

对金银花所测得的数据进行分析发现，在不同产地金银花方面，购入的河南、河北和山东产金银花在颜色上有明显差异，河南产的金银花较其他两个产地的金银花相比a*值更小，说明其颜色较其他两种偏绿；河北产的金银花b*值大于其他两个产地，说明其颜色较偏黄；山东产的金银花L*大于其他两地的金银花，说明其明度更高，颜色更浅。传统鉴别经验认为金银花偏绿色者为佳[4-6]，从颜色测量值可以推出，河南产的金银花质量优于其他两地，这与传统鉴别经验一致[15]。

样品1-5（未做处理的金银花）的L*值小于经过常温避光、加热、光照储藏的部分样品，说明经过常温避光、加热、光照储藏后，部分金银花的颜色逐渐变白；样品1-5（未做处理的金银花）的a*值为负值，则说明其颜色偏绿，这些样品经过常温避光、加热、光照储藏后，部分样品的a*值逐渐增大为正值，说明其颜色中绿色的成分逐渐减少；样品2、3 在经过加热和光照储藏后，显示其b*逐渐减少，说明其颜色中黄色成分逐渐减少。综上，经过常温避光、加热、光照储藏后，金银花的L*、a*值逐渐增大，b*值逐渐减小，说明颜色逐渐变浅。

采用色度仪对金银花颜色进行分析后，将颜色测定值和性状鉴定结果相结合，对金银花的五类颜色划定大致范围，见表5。通过对每类颜色的L*、a*、b*值的范围划定，使我们对金银花颜色的描述由主观的视觉判断和感性描述变为定量的客观的描述。

表5 金银花五类颜色的L*、a*、b*值范围表

将表4 数据以EXCEL 文件保存,然后输入到SIMCA-P + 13.0 软件（Umetrics，Sweden）进行分析。数据采用OPLS-DA 分析，分析过程中根据3.1 性状鉴别结果项下表3 将样品按照颜色不同分为5 类，结果见图2。

图2 不同颜色金银花的L*、a*、b*OPLS分析

从表5 和图2 可以看出部分范围区间有交叉重合现象，这是由目测颜色分类不准确引起的，说明传统性状鉴别对颜色的主观性描述难以客观、准确地评价药材的质量。传统感官评价很大程度上依赖于操作者的经验判断，有着很强的经验性和主观性，例如对药材颜色的描述黄白色、黄色等词语，这种模糊语言的描述，相互之间并没有明确的界限，可能对于同一种中药，不同的人观察后做出的判断可能不太相同，即使经验丰富的中药鉴定人员也不易分辨清楚，而且人的感觉器官容易疲劳。

表6 不同产地及处理方式金银花样品分组

3.3 气味测量结果分析

用电子鼻分别对41份样品按2.3实验条件进行测试，每份样品重复3 次。釆集了12 根传感器响应值数据，将电子鼻测量结果建立判别因子分析判别模型。

3.3.1 不同产地及处理方式金银花样品判别模型的建立

将样品按不同产地及处理方式分组，分组情况见表6。

利用每份样品的每根传感器最大响应值进行DFA分析，分析结果见图3。

如图所示，判别因子1 和判别因子2 和大于85%，说明样品区分度很大，DFA 判别模型能够较好的区分不同组别的金银花。储藏样品组1、2、3 和样品组4、8均是常温状态下放置、未经过加热和光照处理的样品，判别结果将其聚为了一类。判别结果将样品组5、7、9 聚为了一类，这几组样品均是经过光照处理后的样品。样品组6 单独聚成了一组，其特点是经过加热处理后的样品。所有样品均经过确认，识别值均为100%。说明不同的金银花在“气”（挥发性成分的种类和含量）上有一定的区别，并且DFA 模型能够很好的区分气味浓郁和气微的金银花。

图3 不同产地及处理方式金银花样品的DFA判别模型

表7 金银花不同储藏期分组

3.3.2 不同储藏期判别模型的建立

将样品按不同储藏期分组，分组情况见表7。

将表7的数据进行判别分析，分析结果见图4。

图4 不同储藏期金银花样品的DFA判别模型

如图所示，判别因子1 和判别因子2 和大于85%，说明DFA 判别模型能够将不同储藏期的金银花进行较好的分类。判别结果将分组1 单独聚为了一类；分组2、3 聚为了一类；分组4 聚为了一类；分组5、6、7、8聚为了一类。未经过储藏样品、短期储藏样品和长期储藏样品在电子鼻结果分析上有很好的区分，所有样品均经过确认，识别值均为100%，表明存储时间不同的金银花在“气”（挥发性气体的种类和含量）上有着一定的区别，并且DFA 模型能够很好的区分气味浓郁和气微的金银花。

4 讨论

本课题组将仿生识别仪器——色度计与电子鼻引入中药品质评价中，对颜色、“气”进行客观测定，同时对各指标成分进行含量测定，将代表颜色、“气”的指标值与代表质量指标值相联系，探索颜色、“气”与有效成分之间的相关性，揭示了传统性状鉴别经验的合理性，将老药工传承下来的鉴别经验数字化，并且可通过对颜色、“气”的测量，快速地判断或预测药材有效成分含量，完善中药品质的评价模式，推进中药现代化。课题组前期已对金银花颜色、“气味”与其所含化学成分的相关性进行研究，发现在一定程度上，金银花颜色测量值L*越小，所含的绿原酸含量越低；多酚类、叶绿素含量与颜色值关系规律不明显。金银花“气”综合指标值与绿原酸、多酚类含量有显著性正相关关系；与木犀草苷之间不存在显著相关关系，证明金银花的颜色、“气”与其内在的化学成分密切相关，并已发表文章[45-48]。本文则侧重于为传统中药性状鉴别中感官颜色与“气”的客观化、数字化分析方法的建立提供参考，用于指导实践。