补肾壮督方对大鼠退变髓核组织中miR-155-5p及凋亡相关蛋白的影响＊

周文明，林一峰，张 震，白荣飞

（1. 广州中医药大学 广州 510000；2. 广州中医药大学附属骨伤科医院 广州 510240；3. 深圳市沙井人民医院 深圳 518104；4. 广东省中医院 广州 510030）

椎间盘退行性病变（intervertebral disc degeneration，IDD）是造成腰腿痛的重要原因之一[1]。研究表明，过度的细胞凋亡引起的髓核细胞减少在椎间盘退变中起着关键作用[2]。Gruber 等[3]研究发现，在术中取出的退变和衰老的椎间盘，其细胞凋亡率为53%-73%。在髓核细胞凋亡中，线粒体凋亡通路发挥着重要作用[4]。近年来，miRNA 与髓核细胞凋亡之间的关系受到关注，其中有文献报道miR-155 参与了髓核细胞凋亡的调控[5-6]。

补肾壮督方是林一峰教授通过长期临床所得的经验方，主要由鹿角胶、海马、黄芪、熟地黄、细辛所组成。适用于椎间盘退行性变所导致的颈椎病、腰椎间盘突出、椎管狭窄症等疾病。在临床应用中，补肾壮督方对于改善患者局部疼痛、酸麻胀痛等神经症状效果明显[7]。

本研究通过建立大鼠椎间盘退变模型，分组给予补肾壮督方干预后，观察miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc 及active Caspase-3 表达差异，探讨髓核细胞凋亡与以上表达差异之间的关系，以及补肾壮督方治疗椎间盘退变的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄SPF 级雄性SD 大鼠100 只，购于广州中医药大学实验动物中心（实验动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0034），体重350 ± 50 g。在标准条件下进行适应性饲养7天。

1.2 中药制备

补肾壮督方配方组成如下：鹿角胶10 g、海马5 g、黄芪30 g、熟地黄20 g、细辛4 g。（以上中药由广州中医药大学第三附属医院中药房提供）

按上述比例将饮片制成粗粉（除鹿角胶外），按上述比例将中药混合后，加6 倍量水后浸泡30 min，武火煮沸后再文火30 min取汁；药渣再加5倍水量，同前法煎煮，将以上两次煎煮好的药液均匀混合，以滤网滤除药渣，将鹿角胶烊化后溶入药液中，后用旋转蒸发仪浓缩至1.8 g·mL-1，常温冷却后，置于冰箱中保存备用。

1.3 主要试剂

水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司（批号：20170305）；Tunel 试剂盒试剂盒购自罗氏制药有限公司（批号：A0306）；Anti-Bax 抗体（批号：J3216）、Anti-Bcl-2抗体（批号：D1638）、Anti-Active Caspase-3抗体（批号：K1005），Anti-Cytochrome C（批号：G0311）抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司；Primers（批号：DH1203）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP 羊抗鼠（批号：108623）、HRP 羊抗兔购自武汉博士德生物公司(批号：230164)；BeyoECL Plus 购自上海碧云天生物技术有限公司（批号：KJ3511）；TRE-Trizol（批号：15596-026）购自赛默飞（中国）有限公司；Allin-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit（批 号：AOMD-Q050）购 自美国GeneCopoeia 公司；miRcTte miRNA Isolation Kit（批号：DP501）购自天根生化有限公司；SYBR Premix Ex Taq II（批号：GH3059）购自宝日生物技术有限公司。

1.4 主要仪器

恒温摇床（上海博迅公司）；荧光倒置显微镜（德国徕卡公司）；激光扫描共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss公司）；台式高速离心机（中科中佳公司）；半干转膜仪、电泳仪及凝胶成像系统（上海天能公司）；Real Time PCR 仪及凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）。

1.5 造模分组及中药灌胃

按体重分层后，采用随机数字表法将100 只大鼠分为五组，分别为空白对照组、模型组、低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组，每组20 只。10%水合氯醛腹腔麻醉，空白对照组仅暴露椎间盘（未穿刺椎间盘）。除空白对照组外，其他组均参照崔立扬等椎间盘穿刺造模法造模[8]。术后给予8 万单位青霉素肌注，0.2 mL/只，连续用药3天。造模成功后，对高、中、低剂量组大鼠分别予以中药灌胃，灌胃前将药液置于温水中恢复常温后，按高、中、低剂量组分别给予1 mL、2 mL、4 mL 药液，上下午各灌胃1 次。空白对照组和模型组则分别予等量生理盐水灌胃。

表1 引物名称、序列及产物长度

1.6 标本采集

按上述方法中药灌胃4 周后，每组随机抽出10 只大鼠，腹腔注射麻醉脱颈处死后，通过原切口进入，截取L3/L4、L4/L5 腰椎及其间的椎间盘组织，生理盐水清洗除去血液，剔除纤维环，保留髓核组织，4%中性多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片；部分髓核组织置冻存管内，于液氮中保存备用。

1.7 观察指标

1.7.1 髓核细胞凋亡率

采用TUNEL 法检测髓核细胞凋亡率。髓核组织石蜡切片按常规方法脱蜡至水，PBS清洗，加入蛋白酶K 工作液反应后，再加50 μL TUNEL 反应混合液标本上，盖玻片在暗湿盒中反应37℃×1 h。PBS洗5 min×3，玻片上浸入2μg·mL-1DAPI 染液，DAPI 复染后，加滴荧光封片液。荧光显微镜下，每个样品随机计数5个视野，计算细胞凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%，取其平均值作为最终髓核细胞凋亡指数。

1.7.2 qRT-PCR检测

通过实时定量PCR 技术检测miR-155-5p 及Bax、Bcl-2、Cytc mRNA 的表达。按照试剂盒说明，完成样品前处理及总RNA、miRNA 的提取，cDNA 合成及miRNA 反转录。根据目的基因的种属（大鼠），在NCBI 数据库查询参考核苷酸序列，采用Primer 3.0 设计引物，引物序列无非特异性扩增，应用于实验。反应体系的配制，反应参数参考试剂盒说明进行；该试验扩增曲线和融解曲线应用Bio-Rad CFX96 RT-PCR System 的操作方法进行。运用Bio-Rad CFX96 RTPCR 仪 配 套 的Bio-Rad CFX Manager Software1.6 数据分析软件进行分析，且采用2^-ΔΔCt法来计算。

图1 补肾壮督方对大鼠髓核细胞凋亡影响（原位末端转移酶标记染色，×400）

1.7.3 蛋白质印迹法（Western Blot）检测

采用蛋白质印迹法测定active Caspase-3、Bcl-2、Cytc 及Bax 表达量。采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测。从髓核组织中提取总蛋白，使用考马斯亮蓝G250检测蛋白质溶液的OD值，调整样品的蛋白浓度，完成蛋白定量。随后依次进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗；加入按说明书稀释好的一抗，4℃过夜。孵育后TBST洗涤5 min×3。孵育二抗：按说明书对二抗进行稀释，室温轻摇孵育1 h，孵育完毕TBST 洗涤5 min ×3。在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中，加上显色液，经ECL化学发光，X光片压片，显影、定影、洗片，获取目的条带图像，以GAPDH为内参。

1.7.4 统计学处理

2 结果

2.1 各组凋亡率水平

与空白对照组相比，模型组髓核细胞凋亡指数显著增高（P＜0.05）。补肾壮督方灌胃干预后，高、中、低剂量中药组髓核细胞凋亡指数较模型组均显著降低（P＜0.05）。高、中、低剂量中药组相互比较，中、高剂量组凋亡指数较低剂量组显著降低（P＜0.05），中、高剂量组之间虽有差异，但无统计学意义。下图1 中红色荧光的细胞核为TUNEL 阳性结果，蓝色为DAPI复染的细胞核，与空白对照组相比，髓核细胞凋亡明显增加，从26%增加至65%；与模型组相比，低、中、高剂量组髓核细胞凋亡均有不同程度减少，从41%减少至23%。如下表2、图1所示。

表2 各组大鼠椎间盘髓核细胞凋亡指数

2.2 qRT-PCR检测结果

2.2.1 各组大鼠miR-155-5p表达水平比较

与空白对照组相比，模型组miR-155-5p 表达量显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量组髓核组织中miR-155-5p 表达量显著增加（P＜0.05）；中、高剂量组较低剂量组显著增加（P＜0.05），中、高剂量组之间虽有差异，但无统计学意义。如下表3所示。

表3 各组大鼠髓核细胞miR-155-5p表达量

2.2.2 各组大鼠Bcl-2、Cytc 及Bax 在mRNA 上表达水平比较

（1）与空白对照组相比，模型组Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表达量显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量组椎间盘组织中Bax 及Cytc 在mRNA 水平上表达量显著减少（P＜0.05）。（2）与空白组相比，模型组Bcl-2 在mRNA 水平上表达量显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量组在mRNA 水平上表达量上Bcl-2 明显增加（P＜0.05）；见下表4。

表4 各组大鼠髓核组织Bcl-2、Cytc及Bax mRNA表达量

2.3 Western blot检测结果

与空白组相比，模型组active Caspase-3、Bax 及Cytc 表达量显著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值显著增加（P＜0.05），而Bcl-2 表达量显著减少（P＜0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量组椎间盘组织中active Caspase-3、Bax 及Cytc 显著减少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值增加（P＜0.05）显著减少，而模型组Bcl-2 表达量显著增加（P＜0.05）；active Caspase-3、Bax 及Cytc 在高剂量组较低、中剂量组显著减少（P＜0.05），低、中剂量组之间虽有差异，但无统计学意义；Bcl-2 在高剂量组较低、中剂量组显著增加（P＜0.05），低、中剂量组之间虽有差异，但无统计学意义；Bax/Bcl-2 比值增加（P＜0.05）在低、中、高三个剂量组间均有显著差异（P＜0.05）。见下表5，表6及图2。

表5 各组大鼠髓核组织active Caspase-3及Cytc蛋白表达量

表6 各组大鼠髓核组织Bcl-2、Bax蛋白表达量及Bax/Bcl-2比值

图2 大鼠Active caspase-3、Bcl-2、Bax及Cytc蛋白表达量

3 讨论

椎间盘是一种由纤维和软骨所构成的结构，其主要作用是在椎体间传导压力和吸收震荡。由于其内无血管分布，仅仅依靠组织间的弥散作用来供给营养，加上脊柱负重等因素，从而导致其极易发生退化[9]。在椎间盘退变过程中，由细胞凋亡所介导的髓核细胞减少起到关键性作用[2]。随着髓核细胞的大量凋亡，其所合成的蛋白多糖及Ⅱ型胶原减少，使得髓核作为“压力吸收器”的功能大大减弱，进而导致了椎间盘退变的发生。本实验中通过TUNEL 法检测大鼠退变椎间盘髓核组织中髓核细胞凋亡情况，发现大鼠模型组椎间盘组织内髓核细胞凋亡指数较空白对照组显著增加，中药灌胃后检测发现髓核细胞凋亡指数较模型组不同程度显著减少，这一发现表明在椎间盘退变过程中髓核细胞凋亡发挥了重要作用，补肾壮督方对于抑制髓核细胞凋亡，改善椎间盘退变有显著作用。

miRNA 广泛存在于病毒和真核生物体内，在生物体生长、发育、繁殖和疾病发生等过程中发挥着重要作用[10]。miRNA 在调节蛋白表达过程中通过互补或不完全互补的方式与基因mRNA 相应区域靶向结合，可沉默或抑制靶基因的表达[11]。李涛等[12]通过人结肠癌细胞体外培养及qRT-PCR 检测发现miR-155 较癌旁组织升高，抑制miR-155 表达后，细胞凋亡率增高，线粒体凋亡通路相关蛋白Bcl-2 及Cytc 同时增高。Wang 等[13]研究发现在人髓核细胞中miR-155 可靶向调控FADD 及active Caspase-3，抑制miR-155表达时，FADD 及active Caspase-3 则过表达，导致髓核细胞凋亡。active Caspase-3 是miR-155 的靶蛋白，通过上调miR-155 可导致active Caspase-3 下调，而下调miR-155 则引起active Caspase-3 过表达。本实验通过qRT-PCR 检测显示，miR-155-5p 模型组表达量较空白对照组显著降低，补肾壮督方灌胃后其表达量较模型组显著增高。这表明miR-155-5p 可能参与髓核细胞凋亡的线粒体凋亡通路，并在退变的髓核组织中呈低表达。

在哺乳动物中，线粒体是调节大部分凋亡通路的主要细胞器，其细胞凋亡的调控中心。研究表明，线粒体凋亡通路在髓核细胞凋亡中发挥着重要作用[13]。细胞内部损伤或在应激条件下，上游信号分子作用于线粒体膜，Bcl-2 蛋白家族活化形成蛋白孔道，线粒体PT 孔开放，凋亡活性物质（如Cytc 等）释放，引起下游Caspase-9 活化，并进一步激活active Caspase-3，促使细胞发生不可逆的凋亡。Bcl-2 蛋白家族可以调控线粒体膜通道的开放以及凋亡相关物质的流动，是线粒体凋亡通路中关键分子[4]。其家族成员按照功能可以分为两大类：抑制凋亡家族成员（如Bcl-2）以及促进凋亡家族成员（如Bax）。其中Bcl-2 能稳定线粒体膜功能阻止其释放Cytc及Caspase 家族蛋白，而Bax可促进线粒体跨膜电位下降，引起Cytc 的释放，进而引发凋亡[15-16]。Bax/Bcl-2 比值预示着细胞走向凋亡或存活，其比值有增高趋势则细胞趋向凋亡，下降趋势则趋向存活；本实验研究发现，在基因表达方面，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表达模型组较空白对照组显著增加（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 则显著减少（P＜0.05）；补肾壮督方灌胃干预后，Cytc mRNA、Active Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 表达中药组（低、中、高）较模型组显著减少（P＜0.05），Bcl-2 mRNA 则显著增加。在蛋白表达方面，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表达模型组较空白对照组显著增加（P＜0.05），Bcl-2 则显著减少（P＜0.05），Bax/Bcl-2比值显著增加（P＜0.05）；中药干预后，Cytc、active Caspase-3、Bax 蛋白表达中药组（低、中、高）较模型组显著减少（P＜0.05），Bcl-2 则显著增加（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值显著减小（P＜0.05）；由此我们推测线粒体通路所导致的髓核细胞凋亡参与了椎间盘退变过程，补肾壮督方可减少髓核细胞凋亡进而改善椎间盘退变。

中医中虽无“椎间盘退行性变”一说，但是根据其临床表现，将其归属于“痹症”范畴。本课题组在长期临床中，总结经验认为其病机总属“督脉气衰、阳气不振”，并拟补肾壮督方以“温养督脉”为治则，方中以鹿角胶及海马为君药，以补肾壮督，通阳化气；黄芪、熟地为臣药，以滋阴合阳，补气行血；佐以细辛，以通络化痰，行气止痛[7,17]。在前期实验过程中发现该方可提高椎间盘退变大鼠椎间盘ATP 酶活性，保护线粒体的生理功能，延缓大鼠腰椎间盘退变[18]。

综上所述，椎间盘退变大鼠造模成功后经补肾壮督方干预，髓核细胞凋亡率显著减少，Active Caspase-3、Cytc 和Bax mRNA 及蛋白表达均明显下降，而miR-155-5p、Bcl-2 mRNA 及蛋白表达明显增加，由此推断补肾壮督方的机制可能通过减少Active Caspase-3、Cytc 和Bax 表达，增加Bcl-2 蛋白表达，抑制线粒体通路所导致的髓核细胞凋亡，从而改善椎间盘退行性变。miR-155与线粒体凋亡通路之间的关系尚需进一步研究以阐明。