骨髓间充质干细胞源性微泡修复大鼠早发性卵巢功能不全的自噬机制

邱 婷 周 洁 翁廷松 林敏诗

广州市妇女儿童医疗中心产科(广州 510623)

早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency，POI)以卵泡的过早耗竭为特征，临床表现为闭经和血清促性腺激素升高，严重危害女性的生育力及身心健康。据统计，约有l%的女性40岁之前罹患该病，且有0.1%的患者发病时未满30岁[1]。最近的研究报道，约有2.8%的中国女性患有POI[2]。欧洲人类生殖与胚胎学会(ESHRE)推荐的POI诊断标准为：闭经或月经稀发至少4个月和两次检测血清卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，FSH)水平>25 U/L(间隔4周)[3]。目前POI的治疗方式有激素治疗和免疫治疗等方法恢复卵巢功能，但是这些治疗方法不能促进自身卵巢组织再生修复。目前国内外试图采用干细胞来治疗卵巢早衰，为POI的治疗提供新的途径[4]。

间充质干细胞(MSCs)是一群来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs除了具备多系分化潜能之外，还具有免疫调节能力、抗纤维化、抗凋亡和促血管生成等作用，被广泛应用于细胞替代治疗和再生医学，其主要作用机制是通过干细胞旁分泌的有效成分起作用，比如微泡[5]。MSC广泛存在于全身组织，包括骨髓、脂肪、胎盘，脐带、羊水等。间充质干细胞来源的微泡(MSC-MV)是MSCs 在静息或活化状态下释放到胞外的膜分泌体系，MSC-MV 内含脂质、蛋白质、mRNA 及miRNA 等多种生物活性物质，具有促进组织形态学及功能学修复的作用。细胞自噬作为一个重要的细胞自我稳态调控机制，参与了颗粒细胞生存能力和稳态调节的过程，并进而影响卵泡发育和卵巢功能。已有研究表明，自噬的诱导和调控与颗粒细胞和卵母细胞的凋亡密切相关，并介导了卵泡的闭锁[6]。本研究将应用骨髓间充质干细胞源性微泡治疗大鼠早发卵巢功能不全，治疗后28 d检测卵巢功能及自噬相关蛋白表达情况，明确骨髓间充质干细胞源性微泡修复大鼠早发卵巢功能不全的自噬机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雌性大鼠(8周龄)32只作为实验对象，体质量范围173～225 g，平均(205. 03±12. 63) g，由广州医科大学医学动物实验中心提供。SD 大鼠饲养时控制实验室恒温(20±2)℃，恒湿50%～60%，SD 大鼠常规饲养，自由摄食，饮水，光照12 h，建模前12 h 禁食，试验均通过医院动物伦理委员会批准同意。2 只大鼠用于骨髓间充质干细胞制备，10只大鼠为正常对照组，20 只大鼠用于早发卵巢功能不全模型制备。顺铂购自默克公司(货号P4394)，血清雌二醇(E2，货号D741007)、卵泡刺激素(FSH，货号D731057)、和抗苗勒管激素(AMH，货号D711094)浓度的ELISA 检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，自噬相关蛋白LC 3、P62、GAPDH抗体购自abcam。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的制备 颈椎脱臼法处死实验用 SD 大鼠， 75% 酒精浸泡 60 s，取出后放置于消毒好的手术台上， SD大鼠全身碘伏消毒后铺无菌洞巾，分离皮肤、于髋关节离断下肢剪除踝关节远端， PBS缓冲溶液清洗3次，用5 mL注射器取适量完全培养液(12 mL/只)于无菌烧杯(50 mL)备用，咬骨钳将剔除软组织的骨干两端达骨髓腔，用带针头注射器取上述完全培养液缓慢冲刷骨髓腔2～3次，无菌过滤网过滤即得干细胞，放入培养瓶培养传代。

1.2.2 骨髓间充质干细胞源性微泡制备 将原代骨髓间充质干细胞培养、传代至第3代，待细胞铺满平底后换用 DMEM 过夜(约 14h)培养。不含胎牛血清的 DMEM 原液可刺激骨髓间充质干细胞释放MVs ；采用国际上公认的差速离心法分离微泡，①差速离心：收集细胞培养液，300 g离心10 min，取上清，2000 g离心10 min，取上清，10 000 g离心30 min，取上清。②超高速离心：差速离心上清液液100 000 g离心70 min，一次倾倒离心管，去除上清液。③重悬、洗涤：各离心管分别加入PBS溶液100 μL，并移液枪反复吹打使MSC-MV重新溶解；溶解液体再次超高速离心， 100 000 g离心70 min，用上法倾倒上清，重新加入PBS溶液100 μL，反复吹打，收集于1 mL EP管，所得溶液即为MSC-MV重悬液；冰冻保存。

1.2.3 大鼠早发卵巢功能不全模型制备 模型对照组及微泡组腹腔注射顺铂溶液，第1 天注射 50 mg/kg，第2 天连续注射16 mg/kg 14 d。正常对照组注射等体积灭菌用水。

1.2.4 骨髓间充质干细胞源性微泡移植治疗大鼠早发卵巢功能不全 大鼠卵巢功能不全大鼠建模成功后3 d，微泡组尾静脉注射1 mL 骨髓间充质干细胞来源微泡，干细胞组尾静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞，模型对照组尾静脉注射1 mL生理盐水，正常对照组尾静脉注射1 mL生理盐水。

1.2.5 观察指标检测 ①细胞形态观察。分离获得的骨髓间充质干细胞，分别在培养48 h、3 d、7 d后光镜下进行细胞形态观察。②卵巢功能测定。正常对照组及模型制备后3 d 尾静脉采血，ELISA检测血清FSH、E2 含量明确卵巢功能。正常对照组、模型对照组及骨髓间充质干细胞源性微泡移植后28 d ELISA检测血清FSH、E2、AMH含量了解卵巢储备功能。③自噬指标检测。移植后28 d三组分别取卵巢组织检测自噬相关蛋白LC3、P62，GAPDH为内参。

1.3 统计学方法

本研究全部数据用 SPSS 18 .0 统计软件处理，计量资料用均数±标准差，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨髓间充质干细胞形态观察

接种后的细胞经过48 h的培养后，光镜下观察示：满视野圆形血细胞中间短梭状细胞零星分布，(图1-A)；接种72 h，光镜观察示：瓶底短梭状细胞数量增加，呈集落聚集分布，细胞集落较前变大，(图1-B)；接种第7日，光镜观察示：细胞集群明显、相互交织，细胞呈长条型，似纺锤(图1-C)；接种第10日，光镜观察示：长梭状细胞满视野，90%发生融合(图1-D)。此时可以进行传代处理。

图1 骨髓间充质干细胞下观察(A:原代细胞48 h；B原代细胞接种72 h；C原代细胞接种7 d；D原代细胞接种10 d)

2.2 模型制备后3 d卵巢功能及储备功能测定

模型制备组E2 含量低于正常对照组，模型制备组FSH含量高于正常对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 正常对照及模型制备后3 d E2及FSH水平

2.3 骨髓间充质干细胞源性微泡移植后28 d卵巢功能及储备功能测定移植后28 d，三组E2 水平比较，差异有统计学意义(P<0.001)，移植组E2含量高于模型对照组，三组FSH水平比较，差异有统计学意义(P<0.001)，移植组FSH含量低于模型对照组，三组AMH 比较，差异有统计学意义(P<0.001)，移植组AMH 含量高于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，见表2。

2.4 骨髓间充质干细胞源性微泡移植后28 d卵巢组织自噬相关蛋白检测移植后28 d，卵巢组织自噬相关蛋白检测，与模型对照组相比，微泡移植组的LC3表达升高，P62表达降低，差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

图2 卵巢组织自噬相关蛋白检测图A显示的骨髓间充质干细胞源性微泡移植后28 d卵巢组织自噬相关蛋白LC3及P62的Western Blot 检测条带图B为蛋白条带灰度分析结果， *P<0.01， *P<0.01

3 讨 论

自噬是指细胞通过各种途径在自噬溶酶体内自我消化、分解细胞内受损的细胞器、蛋白质等，是一种不依赖半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)的过程。基础水平的自噬对细胞生长发育、发挥其生物学功能是必要的，细胞通过自噬维持自我稳定，更好的适应各种应激，达到自我更新等[7]。细胞自噬作为一个重要的细胞自我稳态调控机制，参与了颗粒细胞生存能力和稳态调节的过程，并进而影响卵泡发育和卵巢功能，细胞自噬稳态的维持对于正常卵巢功能的发挥至关重要，自噬缺陷可能会造成颗粒细胞基础状态或损伤应激下稳态维持的障碍，表现为一系列生物学行为的异常，颗粒细胞功能的失调损伤了正常卵巢功能的发挥，进而参与了POI疾病的发生和进展，有研究发现自噬相关基因与POI有关[8]。

表2 骨髓间充质干细胞源性微泡移植后28 d卵巢功能及储备功能 n=10

LC3及P62是自噬相关的两个重要蛋白，LC3在细胞内定位于自噬体膜，主要参与自噬体的形成，LC3在细胞内主要存在两种亚型：LC-I型和LC-II型，前者主要参与自噬相关蛋白的募集，后者在自噬的过程中始终定位于自噬体膜上，LC3常被作为自噬起始的标记物，也被作为检测自噬程度的分子标记，研究中所测LC3水平均为LC3-II[9]。P62蛋白是原癌基因C-Myc编码，在细胞内定位于细胞核，当在参与自噬过程中，P62蛋白同样需要先与细胞内泛素化蛋白质相结合，其后与LC3-II蛋白结合形成复合物，并最终在自噬溶酶体中降解，因为P62蛋白随着自噬的不断进行而降解，所以其表达水平与自噬水平呈现负相关[10]。

临床工作中发现化疗物如顺铂会对女性的卵巢造成不可逆的影响，基于此，本研究采用顺铂建立大鼠早发卵巢功能不全模型，模型制备后3 d，模型制备组E2 含量低于正常对照组(P<0.001)，FSH含量高于正常对照组(P<0.001)，提示POI大鼠模型制备成功。之后对顺铂建立的早发卵巢功能不全的大鼠模型进行BMSC-MV尾静脉注射移植治疗，移植后28 d，MV移植组AMH及E2水平高于模型对照组(P<0.001)，提示微泡移植组大鼠的卵巢功能得到了改善，MV移植组FSH水平低于模型对照组(P<0.001)，提示BMSC-MV部分修复了早发卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能。进一步对卵巢组织的自噬相关蛋白进行检测，结果发现，移植后28 d，与模型对照组相比，微泡移植组的LC3表达水平升高，P62表达水平降低(P<0.001)，显示微泡移植组的自噬活性较模型对照组有提高，明确了卵巢组织自噬在BMSC-MV部分修复早发卵巢功能不全模型大鼠的卵巢功能中的重要作用。

综上所述，本研究发现大鼠骨髓间充质干细胞源性微泡可以修复顺铂所致的早发卵巢功能不全大鼠模型的卵巢功能，并且是通过自噬起作用。为将来骨髓间充质干细胞源性微泡在POI临床治疗中的应用打下了坚实的基础。