HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相关肝细胞癌组织中的表达及对预后的影响

曾东，冯艳玲，郑叶，杨月香，石雨涵

肝细胞癌(HCC)已成为全球常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，初期临床症状和体征不典型，早期不易发现，往往延误最佳治疗时机；此外由于该病侵袭转移性强而导致预后极差，因此具有较高的发病率和病死率。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染被广泛认为是导致HCC发生的主要高危因素之一，我国80%的肝癌患者合并HBV感染，HBV感染患者较正常人群发生肝癌的几率更高[1]。作为首个被发现的通过反式作用调控下游基因表达的长链非编码RNA(Lnc RNA)，HOX 转录反义RNA (HOTAIR)已被证实在胃癌、乳腺癌及非小细胞肺癌等多种癌症中表达明显上调，且其高表达与肿瘤耐药、增殖、侵袭及迁移密切相关[2-4]。作为锌指蛋白超家族成员之一，锌指转录因子(Snail)对上皮间叶表型转化(EMT) 具有强大的诱导能力，近年来在肿瘤转移中的作用越来越被重视[5-6]。Wnt3a是Wnt 信号传导通路的关键分子，在胚胎发育、造血、组织再生及细胞增殖分化等生物学过程中发挥关键作用，也在多种肿瘤中异常活化并发挥重要作用[7-8]。目前，关于HOTAIR、Snail和Wnt3a通路蛋白在HBV相关肝细胞癌组织中的表达及对预后的意义报道较为少见。因此，本研究通过检测HOTAIR、Snail和Wnt3a 通路蛋白在HBV相关HCC组织中的表达及其与临床病理特征的关系，旨在探讨三者在HBV相关HCC发生发展过程中的作用及其对预后的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2012年6月—2014年12月于复旦大学附属上海市公共卫生临床中心病理科经手术切除并经病理确诊的HBV相关肝细胞癌组织样本82份，患者血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)为阳性，甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒均为阴性；术前增强CT和腹部B型超声均明确诊断为原发性HCC，且未接受任何抗癌治疗；术后病理组织学确诊为HCC；不合并其他疾病，无器质性疾病和既往恶性肿瘤史。82例中男66例，女16例，年龄36～75 (53.82±9.47) 岁，>50岁49例，≤50岁33例；淋巴结转移25例，无淋巴结转移57例；肿瘤直径：>5 cm 44例，≤5 cm 38例；丙氨酸氨基转移酶(ALT)：升高>2倍17例，≤2倍65例；甲胎蛋白：<400 μg/L 63例，≥400 μg/L 19例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ 期55例；分化程度：低分化21例，中分化49例，高分化12例；E 抗原：阳性11例，阴性71例；未行抗乙肝病毒治疗者72例，行抗乙肝病毒治疗者10例。另外选择同期于医院经手术切除的正常肝组织样本35份，患者无肝炎史，且血清甲型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒等检测均为阴性；临床症状结合腹部CT和B型超声等诊断为肝脏良性血管瘤或肝内胆管多发结石，且术后经病理组织学证实；正常肝组织样本为病变旁组织；不合并其他疾病，且无既往病史。其中男28例，女7例，年龄35～75 (54.13±9.52) 岁，>50岁21例，≤50岁14例；因肝脏良性血管瘤切除8例，因肝内胆管多发结石切除27例。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 qRT-PCR法检测HOTAIR：将收集的HBV相关肝细胞癌组织和正常肝组织，采用Trizol(TaKaRa公司)法提取各组织中总RNA并进行浓度测定，之后采用试剂盒Trans Script mi RNA First-Strand c DNA Synthesis Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)对提取的总RNA进行反转录以获取cDNA，将得到的cDNA作为模板，采用Trans Start Top Green q PCR super Mix(北京全式金生物技术有限公司)进行实时定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，检测HOTAIR在HBV相关肝细胞癌组织和正常肝组织中的表达，引物序列：上游5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’，下游5’-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’；同时以微管蛋白(TUBULIN)作为内参基因，引物序列：上游5’-TGGCTCTGGCTTCACCTCACTC-3’，下游 5’-TCGACCACGGCTGTAGACACC-3’；每个样本均重复3次，采用 2-ΔΔCt计算HOTAIR的相对表达量。以大于正常肝组织中HOTAIR相对表达量平均值2倍判为阳性。

1.2.2 免疫组织化学检测Snail和Wnt3a蛋白：用4%中性甲醛溶液将收集的肝组织样本固定后，依次进行脱水、透明及石蜡包埋，再连续切成5 μm厚的切片，置入二甲苯中脱蜡处理，然后经梯度乙醇浸泡水化及3 mol/L尿素消化，之后采用枸橼酸钠溶液修复抗原，3%双氧水室温下孵育10 min后封闭，弃封闭液，分别加入适量稀释好的一抗Anti-SNAIL抗体(山羊多克隆抗体to SNAIL,Abcam公司)和Anti-Wnt3a抗体(兔多克隆抗体to Wnt3a,Abcam公司)，置于4℃冰箱孵育过夜，次日取出，复温后加磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗干净，再分别加入适量稀释好的二抗驴抗山羊IgG H&L (HRP)(Abcam公司)和山羊抗兔IgG H&L (HRP)(Abcam公司)，室温孵育30 min，PBS洗涤干净。加适量二氨基联苯胺(DAB 显色试剂盒,北京中杉金桥生物技术有限公司)用于显色，作用5 min后加去离子水以使反应终止，苏木素复染后，加1%盐酸酒精进行分化，之后用自来水清洗并经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥后封片，镜检观察。

病理切片需由2位资深专业的病理科医师盲评。在每张切片上随机选取5个高倍镜视野，每个视野随机对200个细胞进行计数，阳性表达为细胞出现棕黄色或黄色颗粒，最终以组织样本中阳性细胞染色强度及其所占比例对染色结果进行综合评定。染色强度计分按照无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色顺序分别计0分、1分、2分、3分。阳性细胞数计分按照无阳性细胞、阳性细胞< 25%、阳性细胞26%～50%、阳性细胞51%～75%、阳性细胞>75%分别计0分、1分、2分、3分及4分。以上2项计分相加后≥3分判为阳性。

1.2.3 随访预后：HBV相关肝细胞癌患者手术后安排专门人员定期进行门诊或电话随访，随访终点为患者死亡时间或2019年12月20日。建议患者至少每3个月于医院行甲胎蛋白、肝脏MR或增强CT、肝功能、乙型肝炎表面抗原、E抗原及血清HBV DNA检查，必要时可行骨扫描或病灶穿刺病理检查。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。计数资料以频数或率(%)表示，比较采用χ2检验；3种蛋白在HBV相关HCC组织中表达的相关性分析采用Spearman秩相关检验；组间生存率比较采用GraphPad Prism软件的Log-rank(Mantel-Cox)检验；生存曲线采用Kaplan-Meier绘制；Cox回归比例风险模型分析影响患者的预后因素。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相关HCC组织中的表达 HBV相关肝细胞癌组织中HOTAIR相对表达量的平均值为(9.85±0.87)，正常肝组织中为(4.69±0.42)，二者比较差异有统计学意义(t/P=33.406/0.000)；HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相关肝细胞癌组织中的阳性表达率分别为85.37%、78.05%及89.02%，在正常肝组织中分别为20.00%、17.14%及25.71%，差异有统计学意义(χ2=46.582、 37.861、 46.896,P均<0.01)，见图1，表1。

表1 HOTAIR、Snail和Wnt3a蛋白表达的阳性率比较 [例(%)]

2.2 HOTAIR、Snail和Wnt3a在不同临床病理特征患者中的表达 HBV相关肝细胞癌组织中HOTAIR、Snail及Wnt3a的表达在不同性别、年龄、E 抗原、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、有无行抗乙肝病毒治疗及甲胎蛋白水平方面比较，差异均无统计学意义 (P>0.05)。HOTAIR在患者不同TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移及肿瘤直径方面比较，差异均有统计学意义 (P<0.01)；Snail在不同TNM 分期和淋巴结转移方面比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；Wnt3a在不同TNM 分期、组织分化程度及肿瘤直径方面比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 82例HBV相关HCC患者中HOTAIR、Snail和Wnt3a表达在不同临床病理特征中表达比较 [例(%)]

2.3 HOTAIR、Snail和Wnt3a在HBV相关HCC组织中表达的相关性 Spearman相关性分析显示，HBV相关肝细胞癌组织中HOTAIR的表达与Snail、Wnt3a的表达呈正相关 (r/P=0.281/0.011、0.296/0.007)，Snail与Wnt3a的表达呈正相关(r/P=0.285/0.009)。

2.4 Cox比例风险回归模型分析HBV相关HCC临床预后的影响因素 结果显示，TNM 分期高、组织分化程度低、淋巴结转移、肿瘤直径大，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表达是影响HBV相关肝细胞癌预后的危险因素 (P<0.05)，见表3。

表3 Cox比例风险回归模型分析HBV相关 HCC临床预后的影响因素

2.5 HOTAIR、Snail和Wnt3a表达与HBV相关肝细胞癌患者的生存分析 HBV相关肝细胞癌82例患者5年总生存率为52.44%。HOTAIR、Snail、Wnt3a阳性患者的5年生存率显著低于其阴性患者(47.14% vs. 83.33%、45.31% vs. 77.78%、47.95% vs. 88.89%)(χ2/P=5.380/0.020,5.937/0.015,5.385/0.020)，见图2。

3 讨 论

目前，肝细胞癌的治疗以手术为主，辅助其他治疗，尽管治疗方法较多，但仅能使患者生存期有限延长，预后效果并不理想。基因突变、染色体变异、表观遗传学改变及多种信号传导通路异常调节均参与肝细胞癌的发生发展，是一个复杂的多阶段过程[9]。乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)由HBV基因组最小的开放式阅读框架X基因(X-ORF) 编码，作为一种反式作用因子不直接结合DNA，而是将多种细胞的基因启动子激活以干扰基因转录和表达，进而影响细胞分化、增殖及细胞信号转导途径[10]。HBV侵染宿主是通过将自身基因组整合到宿主肝细胞基因组中并表达HBx蛋白，最新研究结果表明，HBx蛋白对肝细胞癌侵袭转移及恶性转化具有促进作用，且可通过诱导肝癌细胞发生EMT、促进细胞外基质降解及干扰癌细胞间的黏附连接等途径完成[11]。

位于人类染色体12q13.13区域的HOTAIR不编码蛋白质，但可编码2.2 kb长链非编码RNA 分子，通过改变染色质状态，反式调控下游靶基因表达。早期文献报道，敲除HOTAIR对胃癌细胞的增殖、侵袭具有抑制作用，胃癌细胞在体内的致癌性被有效降低，过表达HOTAIR则使肿瘤细胞的恶性潜能显著增加[12-13]。Troiano等[14]研究显示，喉鳞状细胞癌中HOTAIR呈高表达，且与肿瘤细胞的生长关系密切。转录抑制子超家族成员中的锌指转录因子Snail，可结合上皮钙黏素(E-cadherin, E-cad)启动子区的E-box连接基序，以对E-cad 转录表达发挥抑制作用，从而诱导 EMT 的发生。位于染色体17q21上的Wnt3a是Wnt 经典通路的关键信号分子，经磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和硫酸酯酶-2激活后，对肝癌细胞增殖和裸鼠皮下移植瘤的生长具有促进作用[15]。本研究显示，HBV相关肝细胞癌组织中HOTAIR相对表达量显著高于正常肝组织(P<0.05)。HOTAIR、Snail及Wnt3a在HBV相关肝细胞癌组织中的阳性表达率显著高于正常肝组织(P<0.05)。该结果与以往研究报道一致[16]。HBV相关肝细胞癌组织中HOTAIR、Snail、Wnt3a的表达，两两之间互为显著性正相关(P均<0.05)。细胞实验表明，在人类卵巢癌细胞中，过表达HOTAIR可通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导卵巢癌的发生和抗药性[17]。模型实验显示，HOTAIR通过介导Wnt/β-catenin对MMP-13的调控参与软骨损伤发病[18]。Battistelli等[19]发现，上皮间叶表型转化过程中抑制因子Snail是通过HOTAIR将EZH2招募至特定基因组位点的。肺癌细胞系中敲除Zeb1和Snail1后，E-cad mRNA水平增加，侵袭性降低；敲除β-catenin后使E-cad升高，Zeb1和Snail1降低，进而使肺癌的侵袭性被抑制，表明Wnt信号通路通过Snail1和Zeb1调控肺癌骨转移[20]。以上资料均证实HOTAIR、Snail及Wnt3a之间在多种疾病中具有直接或间接的正相关性，与本研究结果相符。

本研究结果表明，HOTAIR、Snail及Wnt3a均与HBV相关肝细胞癌的恶性生物学行为关系密切。Snail对EMT具有强大的诱导能力，因此极易促进淋巴结转移，从而使其恶性程度增加，TNM 分期升高。异常活化的Wnt3a对肝癌细胞的增殖和分化发挥重要作用，因此，Wnt3a与TNM 分期、组织分化程度及肿瘤直径有关。HOTAIR易与miRNA、靶基因形成竞争性内源RNA网络，通过影响多条通路的基因表达以使该通路被激活，从而促进肿瘤细胞的增殖转移等生物学过程，因此，HOTAIR与TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移及肿瘤直径有关。该结果与HOTAIR、Snail及Wnt3a的生物学作用相符[21]。Cox比例风险模型分析结果显示，除TNM 分期高、组织分化程度低、淋巴结转移、肿瘤直径大外，HOTAIR、Snail及Wnt3a高表达也是影响HBV相关肝细胞癌预后的关键风险因素 (P<0.05)。本研究所选82例HBV相关肝细胞癌患者5年总生存率为52.44%，HOTAIR、Snail及Wnt3a阳性患者的5年生存率均显著低于阴性患者(P<0.05)。以上结果证实，HOTAIR、Snail及Wnt3a不仅参与HBV相关肝细胞癌的发生发展，还严重影响患者的临床预后，降低患者生存率。

综上，HBV相关肝细胞癌中HOTAIR、Snail及Wnt3a均高表达且互为显著正相关性，不仅参与癌症的恶性进展，还是导致患者预后不良的关键风险因素。尽管三者之间的相互作用机制复杂，目前尚不完全清楚，但对HBV相关肝细胞癌的诊治具有重要的潜在价值，今后将深入研究其详细作用机制，为开发针对特定靶点的拮抗剂以有效对抗HBV相关肝细胞癌奠定新的基础。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

曾东：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；冯艳玲：课题设计，论文撰写；郑叶、杨月香：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;石雨涵：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改，统计学分析