麝香乌龙丸对S1P诱导血管内皮细胞通透性的调控作用

马炜秀，王志文，袁强，张爱国，曹颖

类风湿性关节炎(RA)是一种以滑膜病变为主的自身免疫疾病，表现为滑膜组织增生及血管翳生成，继而侵蚀破坏关节[1]。研究表明，RA患者滑膜液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)浓度远超过生理浓度[2]。高浓度S1P与血管内皮细胞表面的受体结合，减弱了内皮细胞间的连接，增加了血管通透性，损害了血管屏障功能[3]。RA新生血管内皮细胞排列不整齐，血管通透性增加，炎性细胞浸润增多，不仅加重滑膜炎性反应，同时侵蚀软骨。由此可见，血管内皮高通透性与RA的持续炎性反应和软骨损伤有着密不可分的关系，增强血管内皮细胞屏障功能，有利于减弱滑膜组织的炎性反应。本研究通过S1P诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)，建立血管内皮高通透性模型，观察麝香乌龙丸对HUVEC通透性及连接蛋白的影响，以及其保护血管屏障减轻RA滑膜炎性反应的可能机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞株：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购于上海中乔新舟生物科技有限公司。(2)药物与试剂：麝香乌龙丸(成分：人工麝香、全蝎、地龙、制川乌、黑豆)委托颈复康药业集团有限公司生产，每粒(100±5)mg。用水提法进行药物粗提物的提取：将高速粉碎后的麝香乌龙丸，按一定比例加入蒸馏水,37℃搅拌浸泡过夜， 37℃下超声80 Hz提取30 min， 离心取上清液冷冻干燥得麝香乌龙丸提取物，无菌过滤后于-20℃保存备用。S1P试剂(英国 Abcam 公司)，RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)， 胎牛血清 (德国Cegrogen公司)，Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化液(美国Gibco公司)；CCK8试剂盒(日本同仁化学研究所)，FITC-BSA(大连美仑生物技术有限公司)，荧光二抗Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体(北京博奥森生物技术有限公司)， Claudin-5兔多克隆抗体(英国Abcam公司)，ZO-1兔多克隆抗体(美国Gene Tex公司)，Occludin 兔多克隆抗体(英国Abcam公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养： 2018年8月—2019年11月于华北理工大学中医学院实验室进行实验。HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培养基培养，1～2 d换液1次，每2～3 d传代1次，传代培养至对数生长期备用。

1.2.2 实验分组：实验分为3组。(1)对照组：HUVEC用含10%FBS的RPMI-1640培养基于37℃、5%CO2培养24 h；(2)S1P诱导组：含10%FBS的RPMI-1640培养基培养HUVEC 24 h后，去掉培养基，PBS冲洗2次，用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培养基干预30 min；(3)药物组：麝香乌龙丸160 μg/ml提取物、10%FBS的RPMI-1640培养基培养HUVEC 24 h，去掉原培养基，PBS冲洗2次， 用含S1P 10 μmol/L 的RPMI-1640培养基干预30 min。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 CCK8实验检测HUVEC增殖抑制率：将HUVEC接种于96孔培养板，当细胞长至80%左右时，用无血清培养基同步24 h。分别加入RPMI-1640培养基及浓度为80、160、320 μg/ml麝香乌龙丸提取物的RPMI-1640培养基，培养24 h，去除原培养基。每孔加入CCK-8 10 μl、RPMI-1640培养基90 μl，继续培养2 h，将酶标仪设置于450 nm波长处，检测OD值。细胞抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，其中，对照组为含HUVEC的培养基+CCK8，实验组为含HUVEC的培养基+CCK8+麝香乌龙丸提取物，空白组为不含HUVEC的培养基+CCK8，实验重复3次，取平均值。

1.3.2 Transwell小室测定HUVEC细胞相对通透性：Transwell小室的上室加入HUVEC悬液，每孔为1×105个/cm2，5%CO2、37℃孵育箱培养，待细胞融合成单层后，按上述实验分组处理各组细胞。上室中加入浓度为0.25 g/L的FITC-BSA 100 μl，下室中加入RPMI-1640无血清培养基600 μl，继续培养1 h。在每个Transwell下室取100 μl培养基置于新96孔板中，荧光酶标仪测定荧光强度。通过以下公式计算滤过率，滤过率(%)=(C下室×V下室/C上室×V上室)×100%。C为收集液体的FITC-BSA质量浓度，V为液体的体积。实验重复3次，取平均值。

1.3.3 连接蛋白免疫荧光染色观察： 将HUVEC接种于盖玻片上，待细胞融合成单层，换成空白RPMI-1640培养基培养24 h，待HUVEC细胞同步化以后，分组处理HUVEC细胞。干预完成后，PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，1%BSA封闭30 min，分别加入一抗ZO-1(1∶100)、occludin(1∶200)、claudin-5(1∶200)，4℃孵育过夜。PBS洗3次，加入荧光二抗(1 ∶100)，37℃避光孵育2 h，PBS洗3次，加入DAPI后室温避光孵育10 min，PBS洗3次，滴入防淬灭溶液，于荧光显微镜下进行观察拍照。

1.3.4 蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测连接蛋白：取生长状态良好的HUVEC细胞，按上述实验分组处理内皮细胞，用PBS洗涤后加入RIPA裂解液，混匀，冰上裂解30 min后，4℃离心收集上清液。BCA试剂盒测蛋白浓度，常规SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭2 h，一抗 ZO-1(1∶500)、occludin(1∶1 000)、claudin-5(1∶1 000)，4℃孵育过夜，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，化学发光法(ECL)显色。以β-actin为内参，进行细胞间蛋白表达的差异比较，并以 Image J软件对条带灰度值进行分析。实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1 各组HUVEC细胞增殖抑制率比较 麝香乌龙丸提取物80、160、320 μg/ml抑制率分别为(1.114±1.483)%、(8.694±0.129)%、(14.839±0.563)%。不同浓度药物组与对照组比较，80 μg/ml时差异无统计学意义(t=1.301，P=0.263)，160、320 μg/ml时比较差异均有统计学意义(t=116.852、45.636，P均=0.000)，160 μg/ml与320 μg/ml比较差异亦有统计学意义(t=18.422，P=0.002)。因此，本实验选取麝香乌龙丸160 μg/ml提取物作为后续实验的干预浓度。

2.2 3组HUVEC细胞通透性比较 3组FITC-BSA滤过率分别为(10.832±0.837)%、(21.002±1.727)%、(16.671±0.452)%。与对照组比较，S1P诱导组细胞FITC-BSA滤过率升高(t=9.180，P=0.001)。与S1P诱导组比较，药物组FITC-BSA滤过率降低(t=4.206，P=0.014)。

2.3 3组免疫荧光检测细胞连接蛋白表达比较 荧光显微镜下观察，对照组HUVEC细胞的ZO-1、claudin-5及occludin蛋白主要分布于细胞边缘，排列良好，荧光强；S1P诱导组3种蛋白表达减少，甚至缺失；药物组3种蛋白表达较S1P诱导组明显增加，见图1、2、3。

2.4 3组Western-blot检测细胞连接蛋白表达比较 与对照组比较， S1P诱导组细胞ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表达明显减少(t/P=7.393/0.002、15.437/0.000、15.808/0.000)，而药物组较S1P诱导组3种蛋白表达上调，差异均有统计学意义(t/P=6.586/0.003、3.554/0.024、2.971/0.041)，见图4、表1。

表1 3组HUVEC细胞连接蛋白表达比较

3 讨 论

RA是一种全身炎性反应性自身免疫疾病。表现为滑膜细胞增生，伴随血管新生及炎性反应浸润。滑膜病变的初期病理特征为血管扩张，扩张的血管提供充足的氧气及营养支持，并促进炎性反应浸润，导致关节滑膜结构异常[4-6]。同时滑膜组织中增生的血管结构发生改变，内皮细胞排列不规则，增加血管通透性，炎细胞浸润，加重滑膜炎性反应。RA的促炎状态与内皮屏障功能有关，Atehortúa 等[7]提出，炎性反应主要影响中小型血管(微血管系统)，内皮屏障功能异常是RA发病机制的重要组成部分，在炎性反应中，血管活性物质和促炎介质会引起血管通透性增加和血管损伤。由此可见，血管屏障功能异常、通透性增加在RA发展过程中起到了重要作用。

内皮间的紧密连接和连接蛋白的黏附特性决定细胞连接的通透性。其中紧密连接为组织结构完整性起到重要作用。紧密连接是由膜相关蛋白和不同类型的跨膜蛋白组成的，如ZO-1、claudin-5及occludin蛋白，这些蛋白将细胞膜与细胞骨架相连接，能够调节血管内皮屏障功能[8-9]。ZO-1在调控内皮细胞屏障功能和形成中发挥重要作用，是调控细胞连接形成的重要组成部分，并且介导肌动蛋白细胞骨架的重组以形成功能性内皮连接[10]。occludin和claudins做为紧密连接蛋白复合物，是跨膜蛋白的关键组成部分，参与了内皮屏障功能调控[11]。claudin-5是claudins家族的蛋白质成员，参与内皮紧密连接的必需膜蛋白，是内皮细胞功能障碍和紧密连接活性的指标[12]，其表达过少或者重新分布，与内皮细胞的高通透性有关。由此可见，细胞接连的稳定是确保血管内皮屏障功能正常的基础。

有研究发现，RA患者滑膜炎性因子持续浸润与S1P水平升高有着密不可分的关系[2]。S1P是一种广泛存在于真核细胞中的鞘磷脂信号分子，主要来源于红细胞及血管内皮细胞。S1P与5种G蛋白(S1P1～5受体)结合，激活多种细胞内信号通路，导致不同的生物学效应,包括调节细胞屏障、细胞迁移、炎性反应因子和黏附分子的表达、血管再生等，是滑膜微血管结构异常的重要原因所在。已有研究表明，高浓度的S1P通过激活S1PR2，进而激活RhoA/RhoA通路，引起F-actin蛋白表达紊乱，并且使ZO-1发生解体，从而导致细胞间连接破坏，内皮屏障功能障碍[3]。由此可以看出，RA滑膜液中高浓度S1P可能是导致滑膜微血管内皮细胞连接减弱和血管内皮通透性增高的原因之一。本研究也证实高浓度S1P能诱导HUVEC细胞的高通透性，与上述文献的研究结果一致，并进一步证实高浓度S1P处理后的HUVEC细胞间连接蛋白明显减少，说明HUVEC通透性的增高与ZO-1、claudin-5及occludin 3种蛋白表达的减少有关。

麝香乌龙丸用于治疗RA有多年的临床实践，且临床疗效确切[13]。以往研究表明，麝香乌龙丸可降低RA患者体内IL-18、FKN/CX3CL1表达[14]。动物实验表明，麝香乌龙丸可改善佐剂性关节炎(RA)大鼠滑膜炎性反应发生及血管翳产生，可能与减少RA大鼠滑膜HIF-1α、MMP-2的表达水平有关[15]。麝香乌龙丸能够抑制滑膜组织增生，减少炎性细胞浸润，减轻软骨和骨的损坏，并且能通过上调VE-cadherin和ZO-1表达改善胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠血管新生[16]。由此可见，麝香乌龙丸治疗RA的作用可能与麝香乌龙丸对血管内皮屏障的保护有关。因此本研究以HUVEC细胞连接为切入点，模拟RA关节中血管内皮细胞高浓度S1P的生存环境，探讨麝香乌龙丸对血管内皮屏障功能的保护作用。结果表明，经麝香乌龙丸预处理后，暴露于高浓度S1P下的HUVEC通透性明显降低。说明麝香乌龙丸对于高浓度S1P诱导的HUVEC通透性增强具有很好的保护作用，而这一作用主要与上调HUVEC中ZO-1、claudin-5及occludin蛋白表达有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

马炜秀：实施研究过程，统计学分析，论文撰写；王志文：课题设计，论文审核；袁强、张爱国：课题设计，统计分析及文献整理；曹颖：课题设计，论文修改及审核