青岛即墨丁字湾潮间带菌种资源及优势度

王淑娴，宋爱环，刘 童，辛美丽，叶海斌，吴海一

(山东省海洋生物研究院 山东省海水养殖病害防治重点实验室，山东 青岛 266104)

潮间带是低潮线与最大高潮线之间的海陆交互地带，虽然区域非常狭窄但却具有很高的生产力。这里有规律性的潮汐涨落，多样化的生境类型，显著的人类活动，微环境的变化非常大，因此潮间带的生物必须具有超强的适应环境的能力。潮间带具有丰富而独特的微生物资源，是微生物聚集的基地，是调查微生物资源、优势度及多样性的重要场所。青岛即墨丁字湾位于即墨、莱阳和海阳三市的交界处，周围被山丘环抱，属海洋性气候，但因受五龙河谷地及莱阳盆地影响，季节性变化较大，年平均降水量801.6 mm，其中6-9月占全年降水量的75.5%，4-8月多生大雾，每年12月至次年2月是冰冻季节[1]。这些独特的地理和气候特点，使得青岛即墨丁字湾地区潮间带沉积物中微生物资源非常丰富。目前文献资料里很少有关于该地区菌种资源及优势度的介绍。鉴于此，本研究从采集青岛即墨丁字湾潮间带沉积物样本入手，通过沉积物中菌种的分离鉴定和优势度分析，对该地区菌种资源和优势度展开调查研究。

1 材料与方法

1.1 沉积物样品

以山东省青岛市即墨区丁字湾潮间带作为采样点(北纬36°32′38″，东经120°51′39″)，在不同位置、不同深度采集沉积物样品，装入无菌密封袋，及时带回实验室分离细菌。

1.2 试剂和仪器

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA，北京陆桥生物试剂有限公司)、生理生化特性微量发酵管(北京陆桥生物试剂有限公司)；Premix Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)；引物合成(上海生工)；PCR仪(日本Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(日本Bio-Rad公司)；微量加样器(Eppendorf公司)。

1.3 菌株分离纯化

参照《微生物学实验》[2]中细菌分离纯化的相关规程，将沉积物样品重悬于无菌过滤海水中，用无菌吸管吸取少量混浊液，涂布于TSA培养基上，30 ℃ 细菌培养箱中过夜培养，挑取典型菌落，进行分离纯化。

1.4 菌落形态及理化特性检测

用接种环挑取少量细菌进行革兰氏染色、镜检。将纯化菌株接种于生理生化特性微量发酵管中，生理生化反应结果参照伯杰细菌检定手册[3]和常见细菌系统鉴定手册[4]，获得细菌鉴定结果。

1.5 16S rRNA测序分析

以各纯化细菌基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA序列扩增的通用引物(见表1)，对各细菌的16S rRNA序列进行测定。PCR反应体系为50 μL体系(见表2)，反应条件见表3。 吸取6 μL的PCR产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳20 min，利用凝胶成像仪观察并拍照。剩余PCR产物送至上海生工生物有限公司测序，登陆NCBI网站将测序结果进行Blast比对，使用MEGA 4.0软件构建系统发育树。

表1 16S rRNA序列扩增的通用引物

表2 PCR反应体系(50 μL)

表3 PCR反应条件

1.6 菌种种类优势度分析

菌种种类优势度计算公式：

di=Ni/N

式中：N表示所在群落的所有菌株的个体数之和，Ni表示菌株i的个体数，di表示菌株i占总物种的百分比。

di≥10%为优势种，1%

2 结果与分析

2.1 菌株分离纯化

在丁字湾潮间带共采集沉积物样品10份，分离到细菌66株。

2.2 菌株分类鉴定

分离菌株的生理生化试验结果如表4所示。结合生理生化特征及16S rRNA序列比对结果可知，沉积物样品中分离到的66株细菌属于细菌域的2个大系统发育类群：变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)中的2个科(Vibrionaceae和Bacillaceae))3个属(Vibrio、Bacillus和Shewanella)。利用MEGA 4.0软件中邻位相接法构建系统发育树(如图1)。

表4 菌株生理生化及革兰氏染色试验结果

2.3 分离菌株的优势度分析

青岛即墨丁字湾潮间带沉积物内地衣芽孢杆菌(12.12%)、枯草芽孢杆菌(22.73%)和蜡状芽孢杆菌(12.12%)属于优势种，其他菌株均为常见种，芽孢杆菌属为优势属(74.24%)。以上结果可以体现出青岛即墨丁字湾潮间带生境下一定的菌种资源及特点。具体如表5所示。

表4续表

表5 丁字湾潮间带菌种资源及优势度结果

3 讨论

潮间带是典型的近岸海洋生态系统，它处在陆地和海洋交界的地方，受到陆地和海洋的共同影响，因此与其他海洋环境明显不同，所以生物多样性及生物量极高，环境变化非常剧烈且周期性强[5]。修复和保护潮间带生态系统首先需要充分了解和认识我国潮间带的生物多样性，才可以进一步利用和开发潮间带资源。由于潮间带特殊的地理环境，陆海源以及人为源的有机物首先在此发生反应并累积，从而导致潮间带中含有种类极为丰富的微生物。潮间带沉积物中细菌资源及多样性研究也越来越引起广大专家学者的重视。王雅苹等[6]研究了黄渤海潮间带底栖细菌、真菌的纬度梯度分布规律，为进一步认识潮间带微生物的多样性及生态功能提供了理论基础。国外也有学者研究发现在潮间带沉积物中，含有非常多样性的古菌，古菌基因占总量的1.6%～4.8%[7]。

本研究从青岛即墨丁字湾潮间带采集沉积物样品，对细菌进行分离纯化，共分离到细菌66株，根据生理生化实验和16S rRNA基因序列分析，综合鉴定分离所得细菌属于变形菌门和厚壁菌门中的3个属(弧菌属、芽孢杆菌属和希瓦氏菌属)。青岛即墨丁字湾潮间带沉积物中枯草芽孢杆菌是最大优势种，芽孢杆菌属为优势属，这与芽孢杆菌的芽孢结构有很大关系。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等，是生命世界中抗逆性最强的一种结构[8-9]，因此芽孢杆菌能够适应潮间带剧烈的环境变化，成为优势种属。

与国外发达的海洋国家相比，我国的基础海洋调查工作处于严重滞后的状态，国内在海洋微生物方面的研究薄弱，对潮间带微生物资源的研究涉及更少。本文的研究结果显示了青岛即墨丁字湾潮间带沉积物中具有较丰富的细菌资源，并对其优势度进行了分析，可为该地区潮间带的生态系统研究提供相应的参考。