碳源类型对热带假丝酵母水解产有机酸性能的影响

曹华金 王艳菊

摘 要：本文利用高效液相色谱，对热带假丝酵母Candida tropicalis 2.4491利用单一碳源（葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸）、复合碳源（葡萄糖+甲醇、葡萄糖+乙醇、葡萄糖+硬脂酸）所产有机酸的种类及含量进行了检测。结果表明：碳源类型对热带假丝酵母代谢产有机酸的种类及含量具有一定影响，所产有机酸均以柠檬酸为主，同时含有少量的乙酸、α-酮戊二酸和苹果酸等。

关键词：热带假丝酵母;有机酸;碳源

中图分类号：TQ929文献标识码：A文章编号：1003-5168（2020）22-0102-04

Abstract： In this paper， the high performance liquid chromatography （HPLC） was used to detect the types and contents of the organic acids， which were metabolized by Candida tropicalis using the single carbon sources （glucose， methanol， ethanol， stearic acid） and the complex carbon sources （glucose mixed with methanol， ethanol and stearic acid）. The results showed that the types of carbon sources slightly affected the production of organic acids. The main organic acids produced were citric acid in all mediums， with a small amount of acetic acid， α-ketoglutarate and malic acids etc.

Keywords： Candida tropicalis;organic acids; carbon source

深入挖掘微生物學、生物化学、代谢组学等方面的新理论新知识，是开发新型污水生物处理工艺的核心[1]。酵母菌是一种开发历史悠久的模式真菌，因其对污染物、低pH等外界条件耐受度强，且大多廉价易得，生物安全性好，可操作性强，可集污水处理、资源回收利用等多重目标于一体，因此具有较大的发展潜力[2-3]。其中，氧化型酵母菌降解废水中有机物的代谢机理是将大分子有机物通过胞外的水解酶分解成葡萄糖等小分子有机物，经糖酵解方式（EMP途径）、三羧酸循环（TCA）等最终转化成CO2和水等，并释放大量能量，最终实现有机污染物的彻底降解。同时，该类酵母菌菌体较大，沉降性能好，易于实现分离[4]。热带假丝酵母（Candida tropicalis）可代谢葡萄糖、甲醇、乙醇和脂肪酸、烃类等物质产TCA循环中的有机酸（柠檬酸、异柠檬酸等）[5-6]。研究热带假丝酵母产有机酸的性能，对提高酵母菌处理有机废水的效率和开发污水处理新工艺具有较强的理论及实践价值。

本文利用热带假丝酵母在不同碳源培养下代谢产有机酸，并应用高效液相色谱对解脂复膜孢酵母利用不同碳源产生有机酸的种类和含量进行检测。

1 实验材料与设备

1.1 菌种

热带假丝酵母（Candida tropicalis）CGMCC 2.4491，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试剂与仪器

碳源（葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸）分析纯，有机酸（甲酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸）色谱纯，购置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他试剂均为市售分析纯。

高压灭菌锅YM50A：上海三申医疗器械有限公司;洁净工作台WOL-SY013：广州沃霖实验室设备有限公司;紫外可见分光光度计Alpha1860S：上海谱元仪器有限公司;生化培养箱SPX-250B：常州金坛宏华仪器厂;pH计PHS-25：上海仪电科学仪器股份有限公司;反相高效液相色谱Nexera UHPLC：日本岛津。

1.3 培养基

热带假丝酵母Candida tropicalis2.4491种子培养基：葡萄糖20 g/L、麦芽浸出粉20 g/L、蛋白胨1 g/L，pH自然，105 ℃灭菌20 min。依据碳源的不同，Candida tropicalis 2.4491产酸培养基分别为：葡萄糖培养基（GM）、甲醇培养基（MM）、乙醇培养基（EM）、硬脂酸培养基（SM）、葡萄糖+甲醇培养基（GMM）、葡萄糖+乙醇培养基（GEM）、葡萄糖+硬脂酸培养基（GSM）共7个。每个培养基含：碳源20 g/L（葡萄糖20 g/L、甲醇20 g/L、乙醇20 g/L、硬脂酸20 g/L、葡萄糖10 g/L+甲醇10 g/L，葡萄糖10 g/L+乙醇10 g/L，葡萄糖10 g/L+硬脂酸10 g/L），酵母粉0.5 g/L，Mandels微量元素1 mL/L，pH为7。

2 实验方法

2.1 菌种培养

种子液制备：斜面活化后的菌种接入种子培养基中，28 ℃、150 r/min培养18 h，作为种子液。发酵培养：将种子液按1.5%（V/V）的接种量接入250 mL三角瓶中（装液100 mL），30 ℃、140 r/min培养72 h。

2.2 检测方法

①还原糖：采用DNS法测定[7]。

②有机酸标准溶液：采用超纯水配制并制作标准曲线（操作略）。

③有机酸的HPLC检测[8]。色谱柱：Eclipse C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 [μm]）;流动相：pH为3.0，CH3OH为3%，KH2PO4为0.10 mol/L;流速：1.0 mL/min;柱温：30 ℃;柱压：100 kPa;进样体积：20 [μL]。培养液经10 000 r/min离心10 min，用一次性无菌注射器（2 mL）配合0.22 [μ]m针筒式有机膜过滤器直接进样检测，以峰面积外标法定量。

3 结果与分析

3.1 pH变化

pH值变化曲线如图1所示。由图1可知，前24 h，纯硬脂酸培养基（SM）为唯一碳源条件下，pH的下降速度低于其他碳源条件下的下降速度;葡萄糖+乙醇（GEM）为碳源时，pH值最低，为2.59。以含葡萄糖为碳源体系的pH均低于不含葡萄糖的体系，说明Candida tropicalis  2.4491对葡萄糖的利用要优先于其他物质。72 h时，各体系的pH值均降至2.2左右。

3.2 葡萄糖为唯一碳源条件下有机酸的变化

葡萄糖为唯一碳源条件下的有机酸变化如图2所示。由图2可知，以葡萄糖为唯一碳源时， Candida tropicalis  2.4491所产有机酸较多的为柠檬酸（最大浓度：1.23 g/L）和甲酸（最大浓度：0.78 g/L），但二者随时间变化的趋势并不一致。Candida tropicalis  2.4491所产乳酸的变化趋势是随着时间的延长而逐渐递减的;Candida tropicalis 2.4491也产生少量的乙酸、苹果酸和α-酮戊二酸，但变化趋势不显著。培养前期和中期（0～48 h），柠檬酸的合成速率大于分解速率，柠檬酸快速积累，48 h时浓度达到最大值（1.23 g/L），之后分解速率大于合成速率，浓度下降。

3.3 甲醇为碳源条件下有机酸的变化

甲醇为碳源条件下有机酸的变化如圖3所示。从图3可知，以甲醇为碳源的两种条件下，Candida tropicalis 2.4491所产苹果酸、乳酸、α-酮戊二酸均较低。在以甲醇为唯一碳源条件下，所产有机酸以琥珀酸为最多，且随着时间的延长浓度不断增加，72 h时达到最大浓度0.56 g/L。同时，在该条件下，所产柠檬酸和乙酸均在48 h以前随着时间的延长而增大，48 h后呈现相反的变化趋势。在葡萄糖+甲醇为碳源条件下，所产有机酸以柠檬酸为最大，且随着时间的延长浓度不断增加，72 h时达到最大浓度0.73 g/L。同时，在该条件下所产甲酸和乙酸在48 h以前随着时间的延长而增大，48 h后呈现相反的变化趋势。含葡萄糖的条件下，柠檬酸和乙酸的含量均高于不含葡萄糖的条件，葡萄糖的加入促进了柠檬酸和乙酸的积累。

3.4 乙醇为碳源条件下有机酸变化

乙醇为碳源条件下有机酸的变化如图4所示。

由图4可知，以乙醇为碳源的两种条件下，Candida tropicalis  2.4491所产有机酸均以柠檬酸为最多，且随着时间的延长浓度不断增加，72 h时都达到最大浓度，分别为0.53 g/L（乙醇为唯一碳源）和0.79 g/L（葡萄糖+乙醇为碳源），葡萄糖的加入促进了柠檬酸的积累;而乳酸、苹果酸、α-酮戊二酸含量均较低，且乳酸随时间延长呈现出逐渐降低的趋势，而苹果酸随时间延长逐渐升高，苹果酸最终浓度均高于乳酸。两种碳源条件下，乙酸的浓度均随时间延长而增加，最终浓度均在0.4 g/L左右（72 h）。

3.5 硬脂酸为碳源条件下有机酸变化

硬脂酸为碳源条件下有机酸的变化如图5所示。由图5可知，以硬脂酸为碳源的两种条件下，Candida tropicalis  2.4491所产乳酸、苹果酸、α-酮戊二酸均较低。在以硬脂酸为唯一碳源条件下，所产有机酸以柠檬酸为最多，且随时间延长浓度增加，72 h时达到最大浓度2.45 g/L。同时，在该条件下所产甲酸和乙酸均在48 h以前随着时间的延长而增大，48 h后有机酸浓度下降。在葡萄糖+硬脂酸为碳源的条件下，所产有机酸以乙酸为最大，且随时间延长浓度增加，72 h时达到最大浓度0.73 g/L。同时，在该条件下所产甲酸和乙酸在48 h以前随着时间的延长而增大，48 h后呈现出相反的变化趋势。存在葡萄糖的条件下柠檬酸和乙酸的含量均高于不含葡萄糖的条件，葡萄糖的加入促进了柠檬酸和乙酸的积累。

4 结论

热带假丝酵母Candida tropicalis  2.4491具有独特的产有机酸能力，经72 h培养，各碳源体系的pH均从7降至2.2左右，其产有机酸的主要代谢途径为三羧酸循环（TCA循环）和乙醛酸循环。在以单一的葡萄糖、甲醇、乙醇、硬脂酸或其混合物为碳源时，所产有机酸种类及含量会有所不同，但主要以柠檬酸为主，最高浓度（2.45 g/L）出现在以硬脂酸为碳源的条件下。

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