小柴胡颗粒基于网络药理学的组方配伍规律解析

毕聪，郑如文，黄海涛，江志强，黄伟，何逸禧，张俊华，吴灏，王永刚，刘宏*，马蓉*

(1.广州白云山光华制药股份有限公司，广东 广州 510285；2.中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275)

小柴胡颗粒由柴胡、黄芩、甘草、党参、半夏、生姜、大枣7味药材组成，系广州白云山光华制药股份有限公司采用现代工艺制成的名优中药品种[1]，具有解表散热，疏肝和胃之功效。现代药理学和临床试验已证明，小柴胡颗粒可发挥抑制炎症、调控免疫、保肝护胃的作用。作为经典抗疫名方，小柴胡制剂被用于治疗非典型性肺炎[2-3]、甲型流感[4]、登革热等传染性疾病，2020年被列入《广东省新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案(试行第二版)》[5]。

复方中药具有多靶点、多途径协同作用的特点，讲究组方的辨证及药材的配伍，其作用的本质与组方的内涵密切相关。网络药理学技术将系统生物学和生物信息学有机结合，通过构建药物生物靶标网络，能够整体性、多层次探寻药物复杂体系与生物复杂系统的相互作用[6]，已成功应用于中药的靶点预测、活性成分筛选、组方科学内涵解析[7-9]等。当前，小柴胡颗粒的组方配伍仅局限于传统方解，仍缺乏基于现代科学理论的解析。有鉴于此，本研究基于网络药理学技术，通过单成分浓度叠加、单靶点作用叠加、多靶点协同作用等方面，阐明小柴胡颗粒的组方的科学内涵，为其现代化、国际化发展提供依据。

1 实验方法

1.1 活性成分筛选及交互分析 利用中药系统药理数据库(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分析平台检索北柴胡、黄芩、甘草、党参、半夏、生姜、大枣化学成分，保留“口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且化合物类药性(drug-like，DL)≥0.18[10]”的成分；同时结合文献补充各味药材的药效成分；构建小柴胡颗粒活性成分数据库。进一步利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、Bioinformatics(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)分析药材间成分交互关系。

1.2 靶点筛选及交互分析 检索TCMSP数据库及参考文献，获取小柴胡颗粒各活性成分作用靶点。利用Venny 2.1、Bioinformatics分析药材间靶点交互关系。

1.3 小柴胡颗粒药材-成分-靶点网络构建 采用Perl脚本和UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)[11]将小柴胡颗粒潜在作用靶点蛋白转化为Gene Symbol，将药材、活性成分及作用靶点相应基因导入Cytoscape 3.7.0(https://cytoscape.org//)，构建小柴胡颗粒药材-成分-靶点网络。将作用靶点相应基因导入插件，更新数据库，种类设置为“Homo sapiens(人类)”，阈值设置P<0.05，其他参数保持默认，分别对潜在靶点进行GO(Gene Ontology)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路分析，并采用GraphPad可视化。

1.4 KEGG通路富集分析 利用Cytoscape 3.7.0“ClueGO”、“CluePedia”功能，对小柴胡颗粒及各味药材潜在靶点进行KEGG分析，并采用GraphPad绘制各药材富集通路热图。

1.5 小柴胡颗粒退热机制分析 基于TNF信号通路，采用KEGG网站(https://www.kegg.jp/)Search & Color Pathway功能对小柴胡颗粒及各味药材在通路中的相应靶点进行标注。

2 结果与讨论

2.1 小柴胡颗粒活性成分筛选 结合TCMSP数据库和文献，筛选得到小柴胡颗粒167个活性成分(见表1)；至少为两种及以上药材共有的成分有9个(见表2)，其中槲皮素、β-谷甾醇为三味药材共有成分(见图1)。结果表明，不同药材在单个成分上可能会发生浓度的叠加，从而增强该成分作用；同时不同成分可相互补充，发挥多成分协同作用。

表1 小柴胡颗粒活性成分筛选

表1(续)

表1(续)

表1(续)

表1(续)

表2 小柴胡颗粒各药材成分交集个数

图1 药材间成分交互韦恩图

2.2 小柴胡颗粒作用靶点筛选 检索TCMSP数据库和参考文献，筛选得到小柴胡颗粒268个潜在作用靶点。其中柴胡成分关联靶点174个、黄芩77个、甘草193个、党参83个、半夏73个、生姜45个、大枣174个，各药材关联靶点交集见表3。柴胡、黄芩关联靶点韦恩图以及党参、半夏、生姜、大枣靶点交互韦恩图见图2。结果表明，小柴胡颗粒可能通过单靶点叠加作用和多靶点协同作用发挥疗效[12]。在单靶点叠加作用方面，小柴胡颗粒各味药材靶点间存在着明显的交集，不同药材的成分可作用于同一靶点，发挥“集团军”作用。这些活性成分可能通过相继与靶点结合，发生浓度、时间上的叠加，从而增强药效和时效性。在多靶点协同作用方面，小柴胡颗粒各味药材可通过多个靶点、通路，在不同的功能模块中产生协同性、整合性作用[13]。

图2 君臣药间、佐药间靶点交互韦恩图

表3 小柴胡颗粒各药材靶点交集个数

2.3 小柴胡颗粒药材-成分-靶点网络构建 将小柴胡颗粒7味药材、167个活性成分、268个潜在作用靶点导入Cytoscape，构建小柴胡颗粒药材-成分-靶点网络图(见图3)。其中绿色为药材，粉红色为活性成分，蓝色为作用靶点。

图3 小柴胡颗粒药材-成分-靶点网络图

2.4 KEGG通路分析 268个潜在作用靶点共富集得到275条作用通路，其中靶点数大于10的作用通路121条。富集靶点数排名前二十条作用通路包括pathways in cancer、metabolic pathways、human cytomegalovirus infection、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等(见图4)，与抗病毒、炎症、免疫、代谢等方面相关。将各味药材的作用靶点富集到通路绘制热图(见图5)，颜色越深表明该药材在该通路富集的靶点个数越多。

图4 小柴胡颗粒KEGG通路图(前20条)

小柴胡颗粒中，柴胡为君药，是常用解表药，透泄少阳之邪、疏泄气机之瘀滞，具有和解表里，疏肝升阳之功效，在方中起主要的治疗作用。柴胡与小柴胡颗粒整体富集的通路相近，主要包括抗病毒-卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、甲型流感(influenza A)等；肝炎-乙型肝炎(hepatitis B)、丙型肝炎(hepatitis C)等；心血管-血液流变及动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)等；免疫炎症丝氨酸-苏氨酸激酶(PI3K-Akt)、白介素-17(IL-17)等信号通路。

黄芩为臣药，苦寒，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，可用于治疗温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽等，在方中可辅助柴胡治疗主证及兼证。黄芩富集的通路主要包括人巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)、人类免疫缺陷病毒1感染(human immunodeficiency virus 1 infection)等自身免疫、病毒感染相关通路；麻疹(Measles)等呼吸道传染病相关通路；丝裂原活化蛋白激酶(PI3K-AKT、MAPK)等炎症相关通路；沙门氏菌感染(Salmonella infection)、致病性大肠杆菌感染(PathogenicEscherichiacoliinfection)等细菌感染相关通路。表明黄芩在加强君药柴胡对免疫、抗炎、抗病毒作用的同时，还增加了处方的抗菌作用。已有报道证实，黄芩能够抑制大肠埃希菌[14]、葡萄球菌[15-16]、沙门氏菌[17]等细菌，以及念珠菌[18]等真菌。

党参、半夏、生姜、大枣为佐药，除作用于抗病毒、抗肿瘤等“主证”相关通路外，还可分别作用于不同“兼证”相关通路。党参补中益气、健脾益肺、养血生津，作用于内分泌抵抗(endocrine resistance)、松弛素(relaxin signaling pathway)等通路，其中松弛素可通过舒张血管保护心脏免于缺血引起的损伤[19]，也可通过一氧化氮调控消化道平滑肌，影响胃肠道运动[20]，还可保护肺免受缺血-再灌注损的保护[21]。研究表明，党参对消化系统、内分泌系统、心血管系统均有显著调节作用[22]。大枣补中益气、养血安神，主要作用通路为fluid shear stress and atherosclerosis等心血管相关通路。在本方中，党参与大枣合用可发挥益气健脾、养血生津的功效。脾主要功能包括胃肠道消化吸收和肝脏内物质转化及能量生成[23]，“养血生津”与血管内皮功能、血液流变、造血因子增殖、唾液分泌等有关，上述通路富集结果与传统中医理论相契合。半夏主要作用于神经活性、激素分泌、代谢相关通路，包括神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、代谢通路(metabolic pathways)、环磷酸腺苷信号通路(cAMP signaling pathway)等，可能与半夏治疗咳嗽、呕吐、晕眩、抑郁症功能相关。研究表明，大鼠呕吐时迷走神经胃支传出活动减弱，半夏可激活该活动起到止呕作用[24]。生姜除作用于神经活性、内分泌通路外，还包括胆碱能突触(cholinergic synapse)、5-羟色胺能突触(serotonergic synapse)等神经传导通路及甲状腺激素信号途径(thyroid hormone signaling pathway)等激素相关通路。胆碱能突触是以乙酰胆碱为传递介质的突触，而乙酰胆碱可影响胃肠道平滑肌兴奋、支气管收缩、心脏节律等生理功能。5-羟色胺则可调节肺血管平滑肌及肺循环[25]、参与肠道运动、肝生成[26]等，与止呕功效密切相关[27]。中医理论认为，半夏、生姜合用可和胃降逆止呕，其机制可能与调控神经活性、神经传导、激素分泌相关。

甘草为使药，《本草纲目》称之为“国老”，可调和诸药，缓解药物毒性、烈性，常见于抗疫和治疗咳嗽方剂。研究发现，甘草可调节P-gp转运蛋白[28]、P450代谢酶[29]等，影响药物的吸收、分布、代谢、排泄，实现调和诸药之功效。本研究中，甘草198个靶点共富集于266条通路，涉及代谢、抗病毒、抗肿瘤、免疫炎症等多个方面，一方面可加强君、臣药作用，另一方面可调节药物配伍的代谢和分布，引诸药直达病所。

2.5 退热机制及配伍规律解析 解表散热为小柴胡颗粒的主效应[30]，有必要进一步阐释其退热机制及配伍规律。病毒、细菌等发热激活物进入体内后，可激活产致热原细胞，促使其释放IL-1、TNF、IFN、MIP-1、IL-6等内生致热原，诱导体温调节中枢释放PGE2、cAMP等发热介质，导致调节性体温升高，从而引起机体各组织器官功能和物质改变。前期工作发现，TNF信号通路为小柴胡颗粒的关键作用通路，该通路参与调控细胞存活、凋亡和分化，与抗病毒、炎症、免疫等生物学功能密切相关[31]，参与机体发热病程[32]。小柴胡颗粒各味药材的靶点标记情况见图6，靶点颜色深浅代表作用药材数量多少，靶点下方柱形颜色代表作用药材种类。

图6 小柴胡颗粒各药材在TNF信号通路中的作用靶点图

小柴胡颗粒7味药材共富集得到TNF信号通路中27个靶点，其中全部7种药材共同作用的核心靶点有5个：核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、胱天蛋白酶3(CASP3)。NF-κB是对有害细胞刺激的第一反应者，可激活多种细胞因子，参与抗病毒、炎症反应等生理过程[33-34]；AP-1为JUN、FOS复合体，影响细胞分化增殖，参与免疫、外界刺激应激等，可调控促炎因子表达[35]；PTGS2，即COX-2，是发热介质PGE2合成的主要限速酶，直接参与了发热、疼痛、炎症反应[36]；MMP9参与细胞重构、组织修复，可通过降解细胞外基质和基底膜，调控细胞因子及趋化因子的活性，促进病毒扩散并参与病毒感染引起的免疫反应[37]，与发热、咳嗽、肺炎病程相关；CASP3参与细胞凋亡，影响病毒扩散、增殖与组织修复[38]。全部7味药材可共同作用于上述5个核心靶点，从凋亡、炎症、免疫、发热介质多靶点多层面发挥退热功效。

在药材配伍方面，君药柴胡与绝大部分靶点密切相关(24个)，发挥主导作用；臣药黄芩除5个核心靶点外，还作用于白细胞趋化因子CCL2、促炎因子IL-6等，增强了柴胡在调控免疫、抑制炎症、退热方面的作用；佐药生姜、半夏、大枣、党参合用，加强了柴胡在炎症因子、趋化因子、PTGS2等方面的作用，有助于缩短病程；使药甘草参与26个靶点相关，可能起到调和诸药的作用。由此可知，小柴胡颗粒7味药材通过组方配伍，能够提高机体免疫力、抑制炎症、调节体温，加速病原体清除，缩短咳嗽、发热病程。

小柴胡颗粒发挥退热疗效的潜在机制如下：(1)调节TNF信号通路上游基因：①作用于IKK α和β催化亚基，调节NF-κB激活状态，NF-κB进一步调控细胞凋亡、炎症一系列活动；②通过JNK、p38、ERK 3个途径调节MAPK通路；③作用于AP-1复合物，调控机体应对外界刺激时的细胞进程；④作用于CASP家族，参与细胞凋亡。(2)调节TNF信号通路下游基因：①作用于促炎趋化因子，影响白细胞趋化及活性、病原体吞噬等免疫过程；②作用于内生致热原，IL-1和IL-6、IFN-γ，直接调控发热介质释放；③作用于基质金属蛋白酶，参与细胞重构、组织修复；④作用于细胞黏附因子，参与免疫细胞的黏附和迁移；⑤作用于产生发热介质的关键酶PTGS2，直接参与体温调控。

3 小结及展望

本研究基于网络药理学技术，通过单成分浓度叠加、单靶点作用叠加、多靶点协同作用等方面，科学解析了小柴胡颗粒的组方配伍规律。君药柴胡发挥主导地位，作用于抗病毒、退热、免疫、炎症等相关通路及靶点；臣药黄芩可加强柴胡作用，同时增加抗菌功效；佐药党参、大枣通过作用于内分泌、松弛素、心血管相关通路及靶点，影响胃肠道、肝脏、血管内皮功能，发挥益气健脾，养血生津的功效；佐药半夏、生姜通过控神经活性、神经传导、激素分泌，发挥和胃降逆止呕、抗抑郁的功效；使药甘草具有调和诸药的作用。同时，本研究发现小柴胡颗粒7味药材共同作用的5个核心靶点，对其退热疗效及药材配伍具有重要作用。本研究为小柴胡颗粒科学内涵的挖掘提供了依据，为后续作用机制与靶点的确证提供了参考。