HPLC法测定断血流口服液中断血流皂苷A的含量

林凡友，孙永喜，陈仁燕

(翔宇药业股份有限公司，山东 临沂 276023)

断血流是一种民间传统用药，含有多种化学成分，具有止血、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎等药理作用，临床上主要应用于治疗各种出血症[1-2]。断血流口服液是由断血流药材经提取浓缩等工艺制成的口服液，具有凉血止血的功效。适用于血热妄行的出血证候，用于功能性子宫出血，产后出血，子宫肌瘤出血，单纯性紫癜，原发性血小板减少性紫癜系血热妄行者[3]。目前现行标准是原国家食品药品监督管理总局发布的国家药品标准(WS-546(X-079)-2000-2016Z)，其中断血流口服液含量检测方法为薄层扫描法，目前广泛用于测定断血流皂苷含量的方法有高效液相色谱法[4-5]、紫外分光光度计法[6]，为提高断血流口服液含量检测的准确性，试验制定了高效液相色谱(HPLC)法检测断血流口服液中的断血流皂苷A，并对该含量测定方法进行了方法学验证。试验表明，该方法简单，可以有效地检测断血流口服液中断血流皂苷A的含量，准确地控制制剂有效成分，保证产品质量。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(紫外检测器，型号：G1314F，美国安捷伦公司)；AUW220D型电子天平。断血流皂苷A对照品(批号：110782-200602)来源于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，来源于美国天地有限公司；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。断血流口服液样品来源于翔宇药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(75∶25)，检测波长250 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，进样量为20 μL。理论板数按断血流皂苷A峰计算应不低于3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取断血流口服液适量(批号：200401)，精密量取本品1 mL，加水24 mL，摇匀，置分液漏斗中，加水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的氨试液30 mL洗涤，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30 mL，取正丁醇蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 称取五氧化二磷减压干燥器内干燥12 h的断血流皂苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含500 μg的溶液，即得对照品贮备溶液，精密吸取对照品贮备液适量，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得对照品溶液。

2.2.3 阴性供试品溶液制备 取不含断血流药材的阴性样品适量，同供试品溶液制备处理方法，配制成阴性供试品溶液。

2.3 专属性试验 分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各20 μL，用高效液相色谱仪测定，如图1。在该色谱条件下阴性样品对样品峰没有干扰；主峰保留时间在20 min左右，理论板数按断血流皂苷A峰计算大于3 000，说明该方法专属性良好。

图1 断血流口服液专属性试验HPLC色谱图

2.4 线性试验 精密吸取对照品储备液适量分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释制成浓度分别为2.21、6.63、8.84、11.05、16.58、22.1 μg·mL-1的溶液，分别作为20%、60%、80%、100%、150%、200%的线性溶液，依法测定断血流皂苷A的含量。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。由试验结果可知，断血流皂苷A含量在2.21～22.1 μg·mL-1的浓度范围内，线性方程为Y=32.493X+1.241 3，r=0.999 9(n=6)，峰面积和浓度均呈现良好线性关系，结果见图2。

图2 断血流皂苷A含量测定线性关系标准曲线图

2.5 系统精密度试验 取对照品溶液，重复测6次，并记录色谱图。结果表明：峰面积的RSD值为0.27%，表明该方法的系统精密度良好。

2.6 重复性试验 精密量取一批样品6份，按供试品制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算含量为0.816 mg·mL-1，含量RSD为1.83%，表明该方法的重复性较好。

2.7 稳定性试验 将供试品溶液于室温条件下放置12 h，分别于0、1、2、4、6、8、10、12 h测定。结果表明，在室温条件下放置12 h内，测得供试品峰面积的相对标准偏差为0.40%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取断血流口服液样品(批号：200401，断血流皂苷A含量为0.816 mg·mL-1)适量，每个容量瓶中分别精密加入0.5 mL，共9份，分别加入适量对照品溶液与供试品中待测成分含量之比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1，依法测定，如表1。由试验结果可知，含量测定各浓度下回收率在98.49%～101.51%范围内，平均值为99.66%，RSD为1.12%，表明该方法回收率良好。

表1 断血流口服液含量测定回收率试验结果(n=9)

2.9 耐用性试验 分别考察了标准色谱条件及柱温(20、30 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、 流动相比例(73∶27～77∶23)、不同品牌柱子(迪瓦、月旭、热电)条件下，分别测定含量。结果表明，在柱温、色谱柱、流动相比例及流速等变动因素有微小变化

时，断血流皂苷A含量RSD为1.13%，断血流皂苷A含量测定试验结果均基本没有变化，表明该方法的耐用性良好。

2.10 样品含量测定 取3批断血流口服液，依法测定断血流皂苷A含量，结果如表2所示。

表2 断血流口服液样品中断血流皂苷A含量测定结果

3 讨论

3.1 流动相考察 考察了流动相甲醇-水(71∶29)[7]、甲醇-水(75∶25)[8-9]、甲醇-0.5%磷酸(75∶25)[10]，经研究发现，流动相为甲醇-0.5%磷酸(75∶25)时，在峰前有个小鼓包且基线不平，流动相为甲醇-水(71∶29)时，断血流皂苷A含量较流动相为甲醇-水(75∶25)时低，流动相为甲醇-水(75∶25)时断血流皂苷A峰对称性好，基线平，杂峰少，能准确检测断血流皂苷A色谱峰。

3.2 波长的选择 通过对断血流皂苷A对照品溶液的紫外吸收全波长扫描，确定在250 nm处，断血流皂苷A有最大吸收，故选用250 nm作为高效液相色谱检测波长。

断血流口服液是纯中药制剂，安全有效、副作用小，其所含成分复杂，经药理和临床试验证明，其皂苷类成分对于止血具有治疗出血的作用，因此选择检测断血流皂苷A来控制断血流口服液有效成分及样品质量[11]。本文采用高效液相色谱法测定断血流口服液中的断血流皂苷A的含量，操作简单，含量准确，灵敏度高，耐用性强，能准确控制药物的质量，可以作为检测断血流口服液中断血流皂苷A的含量。