肝脏细胞自噬在肝纤维化中的作用研究进展

陈柳，李敏，王晓萍，强磊

(中国药科大学，江苏 南京 211198)

肝纤维化是由于细胞间基质蓄积引起的肝脏纤维组织的异常增生。肝纤维化的不完全可逆性可能进一步恶化为早期肝硬化、肝衰竭或肝癌，约10%的肝癌患者将发展演变为恶性肝癌，最终可能导致患者死亡[1-2]。肝纤维化的发生有多种诱因，其中包括：酗酒、病毒(hepatitis B virus,HBV/ hepatitis C virus,HCV)性肝炎、自身细胞免疫性肝炎、非病毒酒精性肝炎和脂肪病毒性肝炎等。肝纤维化的发生是长期慢性肝损伤的一个必然结果，而肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化的中心环节[3]。HSC的激活促进纤维化的转录和分泌。近些年研究发现，自噬参与了多种肝脏疾病(包括酒精诱导的肝纤维化、非酒精性脂肪肝以及病毒性肝炎等)的发生过程[4-5]。自噬对肝纤维化的调控是广泛而复杂的，既具有促进纤维化的作用，也有抗肝纤维化的作用。肝纤维化属于可逆性病变，虽然人们对其发生、发展机制有了一定的认知，但是自噬在肝纤维化中的作用还不是特别清晰。本文就不同肝细胞自噬在肝纤维化发展中的作用做一综述。

1 自噬的概述

自噬(autophagy)是维持机体内环境稳态的自身消化代谢过程，可以将胞质中的细胞器、蛋白和大分子等物质分解后再利用[6]。根据细胞成分运输至溶酶体的方式将自噬分为3种类型：大自噬(macroautophagy，人们通常认为的自噬)、伴侣蛋白介导的自噬(chaperone mediated autophagy,CMA)和微自噬(microautophagy)。巨自噬即狭义的自噬，目前已发现40多种自噬相关基因(autophagy related gene，ATG)，其中有一系列基因与自噬体的形成密切相关(如ATG110、ATG12-14、ATG16、ATG18等)[7]。自噬基本过程是游离膜包裹细胞内需要降解的成分形成吞噬体，吞噬体进一步通过选择性和非选择性的途径招募细胞质成分组装成自噬小体，自噬小体和溶酶体膜融合形成自噬溶酶体降解膜内包裹的物质。此外，巨自噬过程中还需要p62/SQTM1，beclin1等关键蛋白的参与。自噬，参与了发育、衰老、细胞程序性死亡等许多重要的生理过程，在肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等各种疾病的发病机制中起着十分重要的作用[8]。自噬在肝脏疾病中起着广泛而复杂的作用，特别是肝纤维化发生发展过程[9]。肝纤维化是持续性肝损伤和肝脏炎症长期影响的必然结果。肝脏损伤时，HSC受到旁分泌作用转化为肌成纤维细胞(myo-fibro blaster，MFB)，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增加，细胞外基质在肝脏过度沉积将表现为肝内纤维结缔组织异常增生[10]。自噬在肝脏内不同类型的细胞中对肝纤维化的调控作用不同[11](如图1)。一方面，自噬通过调节肝星状细胞的脂质代谢和激活肝星状细胞的活化促进肝纤维化的发展；另一方面，自噬通过调控肝巨噬细胞、肝实质细胞和肝内皮细胞在肝脏炎症、肝损伤应答和肝脏代谢稳态等细胞功能抑制肝纤维化[12-13]。

图1 肝细胞自噬在肝纤维化中的特异性功能

肝细胞损伤通过加速炎症和激活肝星状细胞(HSC)而引发纤维化。不同肝细胞的自噬在肝纤维化过程中起着复杂的作用。在肝细胞、巨噬细胞和内皮细胞中，自噬间接抑制肝纤维化，①影响脂肪代谢，减少凋亡；②降低IL-1α和IL-1β；③维持内皮细胞的稳态。HSC自噬直接促进肝纤维化。蓄积激活的HSC可促进肝纤维化的发生，ROS和ER损伤可促进肝纤维化的发生，但维生素D受体(VDR)和法尼酯X受体(FXR)可抑制肝纤维化的发生。

2 肝细胞自噬与肝纤维化

2.1 肝星状细胞自噬 肝纤维化发生过程中，HSC的持续激活是肝纤维化的关键环节。肝星状细胞的活化分为两个阶段：起始阶段和拓展阶段。初始阶段是肝损伤释放的多种细胞因子作用于HSC，核内转录发生一系列的变化激活HSC。拓展阶段是激活的HSC获得了收缩型、趋化型和纤维增生等表型。HSC的激活是一个广泛而复杂的调控过程，自噬通过影响肝内多种细胞因子的分泌和信号通路调控肝损伤和肝纤维化的发展[8-10]。脂质滴(lipid droplet,LD)耗竭是HSC激活的重要特征[14]。肝星状细胞自噬促进LD降解，为诱导HSC的活化和增殖提供能量[15-16]。抑制HSC自噬会减慢HSC活化过程，下调HSC分泌细胞外基质(ECM)。HSC特异性敲除Atg7基因的小鼠会减弱对肝损伤的应答反应并促进肝纤维化[17]。而自噬基因Atg5的过表达加速了静态HSC中LD的降解[17]，促进HSC激活。HSC自噬可促进hedgehog (Hh)信号通路Smo蛋白活性，激活Gli蛋白进入核内调控下游靶基因转录。Hedgehog (Hh) 信号通路通过激活靶基因Yes相关蛋白(Yes associated protein,YAP)来调节HSC的祖细胞分化和转分化[18-20]。肝星状细胞自噬可能通过转录因子YAP调节HSC的分化和转分化促进肝纤维化的进展。

许多细胞因子或信号通路可促进HSC自噬影响星状细胞的活化。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是众所周知的炎症诱导剂，可促进HSC和人肝星状细胞(LX-2)的自噬通量和自噬体形成，从而促进脂质的降解[21]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)在肝脏中作用广泛，通过激活HSC自噬影响肝损伤和肝纤维化。ROS上调细胞炎症因子的分泌。炎症因子通过促进Ⅰ型胶原蛋白的表达，TGF-β的蛋白水平和基质金属蛋白酶活性，从而增强大鼠肝纤维化的发展[22]。有研究表明纤维化肝脏富含G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)的配体，大部分可被Gα12偶联的配体激活。Gα12的过表达增强HSC的自噬，促进ROS的产生和肝脏炎症反应[23-24]。法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)选择性抑制NF-κB介导的炎症反应和静止的HSC活化[25]。FXR抑制自噬以维持甚至增强肝细胞存活。

最新研究表明，慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)患者表达更高的高迁移率族box-1(high mobility group protein box-1,HMGB1)蛋白[26]并诱发过度炎症反应[27]，促进肝纤维化和癌变的发生。HMGB1-RAGE信号轴被报道调节HSC和肝纤维化的自噬。HMGB1通过激活p-ERK和抑制p-mTOR信号蛋白与RAGE结合，加剧肝纤维的进展。外源HMGB1通过抑制p-STAT3和p-mTOR信号蛋白诱导自噬和活化静止的HSC，从而分泌更多的HMGB1以增强HMGB1-RAGE轴效应[28-31]。外源性和内源性的HMGB1协同调节HSC激活和肝纤维化。

2.2 肝细胞自噬 肝实质细胞是肝脏中数量最多的细胞，持续性肝损伤通过旁分泌作用激活HSC的活化，促进纤维化过程。肝细胞的基础自噬通过减少细胞凋亡来保护肝细胞免受炎症损伤[32]，而肝细胞中的脂自噬产生的游离脂肪酸为氧化反应提供能量[33]。肝细胞特异性自噬缺失小鼠(Alb-Cre/Atg5)与对照小鼠(C57BL/6)相比，肝脏中p62大量积累，并显示出免疫反应的肝细胞数量减少[34-35]。肝细胞数量减少降低肝细胞对炎症和损伤反应的耐受性。肝细胞自噬缺失通过WNT信号的激活促进肝实质细胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)的分泌，IL-6通过旁分泌途径激活HSC的活化和促进肝纤维化[36-37]。众所周知，mTOR激酶负调节自噬[38]。其中AKT-mTOR通路与细胞生长以及肝纤维化，急性肝炎和肝癌的发展密切相关[39]。肝细胞中AKT-mTOR激活通过负调控自噬促进肝纤维化的发展[40]。

脂肪酸氧化作为肝组织和肌肉组织的主要能量来源，在肝脏的代谢平衡中起着重要作用。脂质是脂肪酸的主要来源，肝细胞脂质积累诱导释放促进HSC活化和增殖的因子，从而增强肝细胞对凋亡的抵抗力，促进肝损伤并抑制肝细胞再生。而肝细胞的自噬活性降低能够促进脂质累积[41-43]。线粒体作为细胞能量产生和氧化呼吸的场所，影响许多慢性炎性疾病(包括肝纤维化)的发生发展[44]。在哺乳动物细胞中，饥饿和低氧诱导的线粒体自噬协同AMPK信号通路可降低转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的分泌和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达[45-46]。最新的研究发现肝细胞衰老可以促进多种炎症因子的分泌，例如IL-6，通过“衰老传染”促进HSC衰老抑制肝纤维化的发展。阻断肝细胞自噬可通过稳定脂肪代谢以及预防细胞凋亡对肝细胞炎症反应和肝纤维化起到保护作用。

2.3 巨噬细胞自噬 持续性肝损伤和肝炎是造成肝纤维化进展的主要诱因。肝巨噬细胞是肝组织中天然免疫细胞，其通过细胞因子、清除细胞碎片和抵抗环境压力引起的过度炎症来维持肝组织内环境稳态，在肝损伤和肝炎的发展中发挥主导作用[47]。肝巨噬细胞自噬作用通过调节炎性细胞因子[尤其是白介素-1α(interleukin-1 α,IL-1α)和白介素-1β(interleukin 1 β,IL-1β)]的释放来减少炎性细胞的募集和炎症反应，抑制肝纤维化的发展[48-49]。髓系细胞自噬基因Atg5的缺失小鼠在长期注射四氯化碳(CCl4)后，提高肝脏中IL-1α和IL-1β的mRNA和蛋白质水平。自噬诱导剂雷帕霉素可抑制巨噬细胞中IL-1α和IL-1β的表达。同时，沉默巨噬细胞中自噬基因Atg5增加了线粒体氧化物(mitochondrion reactive oxygen species,mtROS)的表达并导致线粒体受损，而线粒体的损伤正是肝脏炎症反应的主要诱因之一[50]。巨噬细胞敲低Atg7基因的表达也发生了类似的趋势[50-51]。进一步的研究证实，自噬缺失会激活NF-κB通路，这与IL-1α和IL-1β分泌表达密切相关。IKKβ抑制剂ML120b抑制了IL-1α和IL-1β的分泌[52-53]。自噬缺失上调IL-1α和IL-1β的产生与mtROS依赖性NF-κB途径激活相关。另一个研究结果表明，巨噬细胞炎性因子IL-1α和IL-1β分泌的增加促进中性粒细胞和单核细胞在肝脏聚集，诱导肝细胞的凋亡。巨噬细胞自噬可能通过另一种肝保护机制抑制肝纤维化[49，53]。

最近的研究报道巨噬细胞的衰老通过增加细胞因子分泌，减少吞噬作用和抑制自噬而促进了炎症因子的表达和分泌[54]。衰老的巨噬细胞不仅能分泌炎症因子影响肝组织的炎症反应，同时也能分泌转化因子TGF-β促进HSC的活化和细胞外基质的合成。衰老抑制了自噬相关基因及其蛋白质(即Atg7、Atg5、Atg4B、Beclin-1和Lamp-2)的表达水平，促进许多炎症因子的表达和释放，进一步影响炎症反应和肝细胞损伤[55]。肝脏衰老引起的巨噬细胞数量增加是自噬依赖的。巨噬细胞自噬在肝脏衰老中引起的炎症反应和肝细胞损伤起保护作用。

2.4 内皮细胞自噬 肝窦内皮细胞在调节肝窦血流和细胞之间的物质交流提供中枢场所，在维持肝功能的正常运行起到十分重要的作用[56]。内皮细胞自噬可维持内皮细胞氧化能量代谢的稳态，在维持HSC稳态起着重要作用。有报道显示内皮细胞是能对区域刺激做出快速的局部反应的动态调节器，内皮细胞自噬能稳定它的动态调节功能。在肝损伤期间，内皮细胞选择性自噬的缺失会加重氧化应激反应从而促进HSC活化[57-58]。肝内皮细胞能够分泌多种细胞因子，其中包括TGF-β，可直接作用于HSC而促进肝纤维化。少量的ROS和灌注损伤会促进内皮细胞线粒体周围的自噬通量和LC3的形成[56]，内皮自噬过度激活也会增强小窝蛋白的降解，从而促进肝纤维化的发生[56]。氧化物的含量可能与自噬和纤维化的激活有关，一氧化氮(NO)依赖性通路相互作用的自噬可能影响内皮细胞的表型和功能。肝内皮细胞开放期间，NO依赖性通路通过PI3K-AKT-MTOR通路的减少和窖蛋白-1(Cav-1)的自噬降解的开始而下调，内皮细胞自噬的缺失降低了肝内一氧化氮的生物利用度，削弱了其抗氧化反应[59-60]。肝内皮细胞中敲低自噬基因ATG7的表达增强氧化应激和肝损伤，从而促进肝纤维化[61]。

3 总结与展望

我国是肝病高发地区，大多数的肝病患者都伴随着肝纤维化的发生，但是目前还没有有效的抗纤维化治疗手段。近年来，细胞自噬研究在肝纤维化中有了一定的进展，细胞自噬在肝纤维化中起着广泛而复杂的作用[4]。自噬在肝脏不同类型细胞中调控不同的信号通路影响肝纤维化发展过程。肝星状细胞自噬通过促进脂质代谢促进肝纤维化的发展[14-15]。在肝实质细胞中，基础自噬具有调节脂肪代谢和减少细胞凋亡影响炎症反应的双重作用[46，62]。肝巨噬细胞中的自噬途径通过抑制炎性细胞因子(尤其是IL-1α和IL-1β)的释放来减少炎性细胞的募集和炎症反应，从而抑制肝纤维化[49，62]。内皮细胞自噬主要维持内皮细胞氧化反应和能量代谢的稳态，从而影响其抗氧化反应和炎症反应[57-58]。综上所述，自噬是一把双刃剑。一方面自噬的抗炎和护肝作用使其发挥抑制肝纤维化的效应;另一方面 HSC自噬则使其具有促肝纤维化作用。以自噬为治疗靶点特异性靶向不同类型肝脏细胞，也许会为肝纤维化治疗过程中提供新的方向。