急性髓细胞性白血病患者骨髓淋巴细胞亚群分析及其临床意义

高燕婷，赵金艳，王 娟，李 佳，许 雯，李 莉，蔺丽慧

（上海交通大学附属第一人民医院检验科，上海 200080）

急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，以造血系统的克隆性增殖和异常分化及病态细胞浸润骨髓、血液和其他组织为特征[1]。2015 年发表的研究数据显示，AML 已成为成年人中发病率和死亡率最高的白血病类型[2-3]。多种因素与成人AML 发病风险相关，如前期血液病、治疗性和非治疗性电离辐射暴露、化学物质和某些化疗药物及化学制剂接触等[4]，这些因素均会导致患者出现获得性染色体异常或基因突变等细胞遗传学改变，且后者与患者的预后密切相关。

美国国家癌症研究所的数据显示，化疗和干细胞移植仍是目前AML 患者的主要治疗方法，患者的5 年相对生存率为28.7%（2010 年至2016 年）[5]。近年来，由于单克隆抗体、免疫治疗及嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法的发展及应用，急性淋巴细胞白血病患者的生存率已获得显著提高，2010 年至2016 年的研究显示，其5 年相对生存率达68.8%[5]，可见，积极探寻监测、治疗AML 的新方法具有十分重要的意义。相关研究已发现，AML 患者白血病细胞与机体免疫系统间存在密切的相互作用。初发AML 患者外周血中的自然杀伤（natural killer,NK）细胞及T 淋巴细胞绝对数量增加，但T 淋巴细胞异常的活化模式使其无法与白血病细胞间建立有效的免疫突触[6]。此外，白血病干细胞间通过下调其表面NKG2D 配体，使其无法被NK 细胞识别，从而逃避机体的免疫监视[7-8]。化疗后，AML 患者的B 细胞功能受损，体液免疫恢复较慢，也为疾病复发提供了机会[9]。现有研究多关注于AML 患者外周血淋巴细胞亚群，而鲜有骨髓中淋巴细胞亚群变化的报道。因此，本研究关注AML 患者骨髓淋巴细胞亚群的免疫功能，比较健康者与不同疾病状态及不同预后风险AML 患者的骨髓中淋巴细胞群体分布百分比，这可能较外周血更直接反映AML 发生、发展过程中机体免疫功能状态的改变，可为临床开展免疫相关治疗提供有效依据。

资料与方法

一、资料

本研究回顾性分析2018 年6 月至2019 年12 月期间在上海市第一人民医院确诊并收治的131 例AML 患者 （包括初诊未治疗原发AML 患者、继发AML 患者及化疗缓解后首次复发AML 患者，排除急性早幼粒细胞白血病患者），同时对复发AML 患者进行病史信息追溯，收集其初发AML 时的骨髓淋巴细胞亚群检测结果。本研究纳入的AML 患者年龄为17～78 岁，中位年龄为49 岁，其中男性患者82 例，女性患者49 例，男性多于女性。

另纳入Oetjen 等[16]公布至Flow Repository 数据平台的20 例健康志愿者骨髓样本流式细胞仪检测结果数据资料作为对照。男性及女性各10 例，年龄为24～84 岁，中位年龄为52 岁，健康者与纳入的AML 患者间的性别（P=0.33）及年龄（P=0.58）差异无统计学意义，具有可比性。

二、方法

本研究中细胞遗传学重排和基因突变检测采用实时荧光定量PCR 及第二代测序方法[10-13]。AML诊断及危险度分层参照2016 版世界卫生组织发布的骨髓恶性肿瘤和急性白血病分类标准[14]及欧洲白血病网 （European Leukemia Net，ELN） 发布的2017 版成人AML 诊断及治疗建议[15]。经患者知情同意后，采集骨髓样本用于流式细胞术检测及分析。

1.仪器及试剂：本研究采用的仪器包括三激光十色流式细胞仪[贝克曼库尔特Navios 商贸（中国）有限公司]、低温低速水平离心机（赛默飞世尔科技公司）。淋巴细胞亚群标记采用直接标记荧光抗体，包括CD45-KO、CD3-PE-Cy7、CD7-APC、CD4-PE-Cy5.5、CD8-PB、CD56-PE、CD19-PE-Cy7、CD20-PB 及CD5-FITC；采用红细胞裂解液（Optilyse C）溶解骨髓红细胞，以上产品均购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。

2.检测：初诊患者取初诊未治疗之前的骨髓样本；复发患者取化疗缓解后首次复发时的骨髓样本。采集患者骨髓样本1～2 mL，置于肝素抗凝管中，在室温下储存，于4 h 内进行检测。每份样本分别进 行T 淋巴细胞及NK 细胞（CD56、CD4、CD3、CD7、CD8、CD45） 和B 淋巴细胞（CD5、CD19、CD20、CD45）标记。向流式细胞仪检测管中分别加入荧光抗体各5 μL 和骨髓细胞5×106个/管，混匀后在室温下避光孵育20 min；加入500 μL 红细胞裂解液溶解骨髓红细胞15 min；加入磷酸盐缓冲液2 mL 洗涤细胞碎片，800×g 离心5 min 后，用500 μL 重悬细胞，并上机检测。每检测管获取淋巴细胞10 000 个。

3.统计学处理：采用贝克曼库尔特Kaluza 2.3分析软件，对健康者及AML 患者骨髓样本淋巴细胞亚群流式细胞仪检测结果进行设门分析。选取CD45+侧向角散射光低的淋巴细胞群，分析CD3+T淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞、NK细胞及CD19+B 淋巴细胞占总淋巴细胞群体的百分比。采用R 3.5.2 进行数据资料处理及统计学分析。AML 组与健康对照组间性别比较采用Fisher确切概率，年龄比较采用非参数秩和检验；2 组间淋巴细胞亚群检测结果呈正态分布数据比较，采用t 检验；多组间比较，正态分布数据采用ANOVA 单因素方差分析；配对样本间比较，正态分布数据采用配对样本t 检验。非正态分布数据比较采用非参数秩和检验；P＜0.05 认为差异有统计学意义。

结 果

一、一般临床资料

131 例AML 患者的临床信息及预后相关的细胞遗传学异常见表1。本组包括AML 初诊患者94 例，继发患者18 例（包括骨髓增生异常综合征转化的AML 患者8 例，治疗相关的AML 患者10 例），复发患者19 例。根据2017 年ELN 发布的遗传学风险分层对94 例初诊患者进行预后分组，其中伴有融合基因 RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11、NPM1 突变不伴或伴低水平FLT3-ITD、CEBPA 双突变的患者风险分类为良好，纳入低危组，共36 例；伴有融合基因KMT2A 重排、野生型NPM1 伴高水平FLT3-ITD、RUNX1 突变（不伴有预后良好的融合基因及突变）、ASXL1 突变（不伴有预后良好的融合基因及突变）、TP53 突变的患者风险分类为不良，纳入高危组，共31 例；NPM1 突变伴高水平FLT3-ITD、野生型NPM1 不伴或伴低水平FLT3-ITD、既非良好也非不良的细胞遗传学异常患者风险分类为中等，纳入中危组，共27 例。各组间比较，性别（P=0.26）及年龄（P=0.19）差异均无统计学意义。

二、健康者及AML 患者的淋巴细胞亚群分布比较

与健康者相比，AML 患者骨髓中总T（CD3+）淋巴细胞百分比、CD4+T 淋巴细胞百分比及NK 细胞百分比差异均无统计学意义。而AML 患者骨髓中CD8+T 淋巴细胞百分比则较健康者显著升高[（31.73%±12.38%比21.40%±7.33%）]（P ＜0.001），CD19+B 淋巴细胞百分比较健康者显著降低（中位数9.62%比14.03%）（P＜0.01），CD4+/CD8+比值较健康者显著降低（1.04 比1.48）（P＜0.05），差异均有统计学意（见图1）。根据发病原因及样本采集时的疾病阶段，将AML分类为初诊、继发和复发状态。与健康者、初诊AML 患者及继发AML 患者比较，复发AML 患者骨髓中的CD3+T 细胞百分比、NK 细胞百分比有升高趋势，CD4+T 细胞百分比有降低趋势，但差异尚无统计学意义（P＞0.05）。复发患者骨髓中的CD8+T细胞百分比显著高于健康者 （P＜0.001）、初诊患者（41.56%±11.64%比29.86%±12.20%）（P＜0.001） 及继发AML 患者（P＜0.05）；初诊AML 患者的CD8+T细胞百分比显著高于健康者（P＜0.01），差异有统计学意义。与健康者相比，初诊组、继发组及复发组AML 患者的CD19+B 淋巴细胞百分比依次减低，差异有统计学意义；复发组的CD19+B 淋巴细胞百分比显著低于初诊组（中位数4.18%比11.82%）（P＜0.05），差异有统计学意义。复发组的CD4/CD8 比值显著低于健康组（P＜0.01）及初诊组（0.59 比1.12）（P＜0.05），差异有统计学意义（见图2）。

表1 131 例AML 患者的细胞遗传学异常[n（%）]

图1 健康者与AML 患者骨髓样本中淋巴细胞亚群比较

根据患者存在的细胞遗传学异常，将初诊AML 患者进一步分为低危、中危及高危3 个不同预后组，3 组间的淋巴细胞亚群分布差异无统计学意义。复发患者骨髓中CD8+T 淋巴细胞百分比均较不同预后的初诊组显著增高（见图3），差异有统计学意义。预后良好的初诊低危组患者骨髓中CD19+B 淋巴细胞百分比显著高于复发患者 （P＜0.01），差异有统计学意义。低危及高危的初诊患者CD4+/CD8+比值显著高于复发患者（P＜0.05），差异有统计学意义。

图2 健康者与不同疾病阶段AML 患者骨髓样本中淋巴细胞亚群比较

图3 不同危险度分层的初诊AML 与继发、复发患者骨髓中淋巴细胞亚群比较

三、复发AML 患者初发与复发状态的骨髓淋巴细胞亚群分布配对比较

回顾性分析19 例复发AML 患者初诊时的临床资料，其中15 例患者可进行配对淋巴细胞亚群比较分析。结果显示，CD19+B 淋巴细胞在AML 复发时显著降低，差异有统计学意义 （2.40%比12.41%，P＜0.05）（见图4）；初发与复发状态配对比较，T 淋巴细胞百分比及NK 细胞百分比差异均无统计学意义。

图4 15 对AML 患者初发与复发骨髓样本中淋巴细胞亚群配对比较

讨 论

一、AML 患者骨髓中淋巴细胞亚群分析的重要性

外周血淋巴细胞亚群分析已广泛用于临床，以评价自身免疫性疾病、过敏及肿瘤等患者的机体免疫功能状态。在总T 细胞中，CD4+T 淋巴细胞介导辅助细胞及体液免疫功能，CD8+T 细胞发挥抑制或杀伤功能效应，CD19+B 细胞主要负责体液免疫，产生抗原特异性抗体，NK 细胞则发挥非特异性细胞毒性效应。现已有较多研究关注AML 患者外周血中淋巴细胞亚群的变化，结果显示新发AML 患者外周血中的淋巴细胞CD3+T 淋巴细胞百分比、CD4+T 淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值均较健康者显著降低[17-19]。但至今鲜有针对AML 患者骨髓中淋巴细胞变化的相关研究。本文研究结果显示，初诊AML 患者骨髓中的CD8+T 淋巴细胞百分比较健康者显著增高，而CD19+B 淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值则较健康人显著降低，表明AML 患者骨髓中的淋巴细胞亚群变化模式与外周血虽有一致的趋势，但并不完全同步，有必要进一步研究。骨髓是人体重要的免疫器官，T、B 系祖细胞均来源于骨髓，除T 淋巴细胞外，B 淋巴细胞和部分NK细胞在骨髓中分化、发育、成熟后释放至外周。另一方面，髓系白血病发生、发展过程中患者的骨髓微环境也发生相应的改变，可能会影响淋巴细胞的产生及功能状态。因此，相较于外周血，分析骨髓淋巴细胞亚群分布可以更准确地反映患者疾病状态与免疫功能间的相关性。

近年来，越来越多的研究显示，抗-CTLA4、抗PD-1 等免疫检查点抑制剂可活化抑制性T 细胞，显著改善实体肿瘤患者的生存期，表明充分调动机体的免疫监视功能，可有效识别和清除体内的恶性转化细胞，为临床抗肿瘤治疗提供新的思路和有效手段[20]。与实体肿瘤不同，白血病患者的病变部位主要在骨髓和外周血，病变细胞与淋巴细胞在空间上有着更加紧密、直接的接触及相互作用，并且造血干细胞移植、供者淋巴细胞输注介导移植物抗肿瘤效应更体现出免疫治疗在血液系统肿瘤治疗中的应用价值。因此，分析和比较AML 发生、发展过程中患者骨髓淋巴细胞亚群分布情况，了解机体免疫状态，对于AML 治疗有一定的指导意义。

二、AML 患者骨髓淋巴细胞亚群的变化及意义

Williams 等[21]在骨髓免疫组化研究中发现，AML患者骨髓中总T 淋巴细胞绝对数及所占淋巴细胞的比例与健康者相比，差异无统计学意义，但采用流式细胞仪分析骨髓CD45+侧向角散射光低的细胞群后发现，AML 患者的总T 淋巴细胞比例较健康者显著增高。本研究结果显示，与健康者相比，AML 患者骨髓中的总T 淋巴细胞和NK 细胞在淋巴细胞中的百分比虽有增高趋势，但差异尚无统计学意义，而AML 患者骨髓中的B 淋巴细胞百分比较健康者显著降低。笔者推测其原因可能是由于B系祖细胞由骨髓造血干细胞分化而来，发生AML时，白血病细胞克隆性增殖抑制了骨髓的正常造血，阻碍了B 淋巴细胞的分化、发育和成熟，而T 淋巴细胞则在胸腺分化发育成熟后通过淋巴及血循环迁移至全身免疫器官和组织，因此其比例分布较少受到骨髓白血病细胞的影响。NK 细胞由NK 前体细胞分化而来，在骨髓中造血干细胞可分化为NK 前体细胞，进而发育为成熟NK[22]。此外，胸腺中的胸腺前体细胞亦可分化为NK 前体细胞[23-24]，周围淋巴器官如脾脏、淋巴结、扁桃体等中也存在NK前体细胞[25]，提示这些组织器官均可能是NK 细胞发育分化的场所。因此，NK 细胞亦较少受到病变骨髓微环境的影响。本研究结果显示，与健康人相比，AML 患者骨髓中CD8+T 淋巴细胞百分比显著增高，导致CD4+/CD8+比值显著下降，这与Williams 等[21]报道的结果一致。研究显示，占比增高的CD8+T 淋巴细胞表面表达高水平的免疫检查点分子OX40及PD-1，因此增高的CD8+T 淋巴细胞处于免疫抑制状态，无法发挥正常的识别和杀伤白血病细胞效应[26]。Knaus 等[27]发现，将来源于AML 患者的外周血CD8+T 淋巴细胞在体外培养，给予OX40 配体或PD-1 抗体，可以部分逆转其细胞毒性功能。

三、不同疾病阶段及预后风险的AML 患者骨髓淋巴细胞亚群的变化

本研究进一步分析患者中初诊、继发及复发AML 患者，发现相较于健康者及初诊AML 患者，复发患者CD8+T 淋巴细胞百分比进一步升高，相反CD4+/CD8+比值、CD19+B 淋巴细胞进一步减低。Williams 等[21]发现，多次复发的AML 患者其骨髓中PD-1+CD8+T 淋巴细胞比例较初发或首次复发的AML 患者显著增高，表明复发AML 患者的骨髓微环境处于持续抑制状态，与本研究结果中复发患者CD8+T 淋巴细胞百分比显著升高、B 淋巴细胞增殖障碍相吻合。Goswami 等[9]的研究发现，化疗后AML 患者外周血中的B 淋巴细胞比例较健康者显著降低，且B 淋巴细胞中具有抗体产生功能的亚群比例较健康者显著降低，认为化疗干扰骨髓中B淋巴细胞的增殖及分化。本研究回顾分析复发AML 患者初发时的病史信息，明确复发的AML 患者均曾接受连续的巩固化疗。然而，初诊AML 患者治疗前低、中、高危3 组的骨髓CD19+B 淋巴细胞中位百分比逐渐降低，继发和复发AML 患者的骨髓CD19+B 淋巴细胞百分比则进一步降低，提示随着预后不良风险的增加，骨髓中CD19+B 淋巴细胞百分比存在下降趋势（见图3）。因此，AML 复发与骨髓中CD19+B 淋巴细胞百分比下降间的关系有待进一步研究证实。

四、本研究的特色及不足之处

在临床上，骨髓穿刺术采集患者骨髓液属于侵入性有创操作，故极少采集健康者骨髓样本。因此，目前在检测和分析患者骨髓免疫功能状态时，缺乏健康对照组进行比较分析。本研究选取Oetjen 等[16]发布共享的20 例健康志愿者骨髓流式细胞仪检测结果数据，经分析显示，该组健康者性别及年龄分布与本研究患者间差异无统计学意义，故采用与AML 患者相同的设门策略分析，获得健康者骨髓淋巴细胞亚群数据。此方法既充分利用了共享的稀缺样本资源，又完善了比较分析。

本研究也有一些不足之处。首先，由于临床上健康骨髓样本难以采集，且现有公共数据平台中缺乏中国人群健康骨髓样本信息，故本研究采用国外健康人数据与中国AML 患者进行比较，无法避免人种差异带来的影响；同时，来自公共数据库的健康者骨髓淋巴细胞亚群检测所标记的荧光抗体与本研究不同，但该因素对研究结果的影响较小。其次，本研究仅分析了骨髓淋巴细胞中T 淋巴细胞、NK 细胞及B 淋巴细胞的相对百分比，缺乏绝对计数的比较，也未对各淋巴细胞群体进行功能分析，限制了笔者全面解析AML 患者的骨髓免疫功能状态。最后，本研究为回顾性分析，未对患者进行跟踪随访，未进行骨髓免疫功能状态改变与患者预后的相关性分析，这将在今后的研究中进一步完善。

总之，本研究结果显示，AML 患者尤其是复发患者的骨髓CD8+T 淋巴细胞百分比显著增高，CD19+B 淋巴细胞百分比显著降低，提示在白血病细胞的作用下，骨髓免疫功能受到显著抑制，因此分析骨髓淋巴细胞亚群分布有助于医师了解AML患者的骨髓免疫功能状态，为免疫相关治疗提供了理论依据。