激光辅助孵化技术对囊胚期冻融胚胎移植患者妊娠结局的影响

冯清 李嘉泓 宋燕 周志伟 段彪 刘娟

【摘要】 目的：探讨激光辅助孵化技术对囊胚期冻融胚胎移植患者妊娠结局的影响。方法：选取2017年1月-2018年12月在本院行冻融囊胚解冻移植技术助孕的339例患者。按激光辅助方式不同分为A组190例和B组149例，A组行透明带削薄，B组行透明带打孔。比较两组胚胎复苏率、胚胎着床率、移植周期妊娠率以及子代出生情况。结果：两组移植胚胎数、优质囊胚率、胚胎解冻复苏率、移植周期妊娠率、胚胎着床率、流产率、活产率、出生缺陷率、早产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：透明带削薄、透明带打孔两种激光辅助在囊胚期冻融胚胎移植中效果相近，临床可根据实际情况选择适宜的辅助孵化技术。

【关键词】 囊胚期冻融胚胎移植 透明带削薄 透明带打孔 妊娠结局

[Abstract] Objective： To explore the effect of laser-assisted incubation technology on pregnancy outcomes in patients with blastocyst stage freeze-thaw embryo transfer. Method： A total of 339 patients who received freeze-thawed blastocyst thawing transplantation in our hospital from January 2017 to December 2018 were selected. According to different laser assisted methods， the patients were divided into group A 190 cases and group B 149 cases. Group A received zona pellucida thinning， while group B received zona pellucida drilling. Embryo recovery rate， embryo implantation rate， pregnancy rate of transplantation cycle and offspring birth were compared between the two groups. Result： The number of transplanted embryos， high quality blastocyst rate， thawing and resuscitation rate of embryos， pregnancy rate of transplantation cycle， embryo implantation rate， abortion rate， live birth rate， birth defect rate and premature birth rate between the two groups compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Two kinds of laser-assisted techniques， zona pellucida thinning and zona pellucida drilling， have similar effects in the freezing-thawing embryo transfer at blastocyst stage， the appropriate auxiliary incubation technology can be selected clinically according to the actual situation.

[Key words] Blastocyst stage freeze-thaw embryo transfer Zona pellucida thinning Zona pellucida drilling Pregnancy outcomes

First-authors address： Peoples Hospital of Ganzhou City， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.27.015

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）会因子宫容受性低和胚胎质量差等因素的影响，降低胚胎种植率[1-2]。冻融过程中，胚胎会因暴露在极低温环境下，加速透明帶的硬化，胚胎发育成胚囊后难以从透明带中孵出，并影响胚胎种植率[3-5]。辅助孵化技术能够帮助胚胎经透明带中孵出，其中激光辅助孵化技术具有安全、快速、准确等优点，能对移植前透明带实施削减厚度或人工开口，促进胚胎孵出，有助于提高临床妊娠率。本研究旨在分析激光辅助孵化技术对囊胚期冻融胚胎移植患者妊娠结局的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月-2018年12月在本院行冻融囊胚解冻移植技术助孕的339例患者。（1）纳入标准：①年龄<37岁;②行IVF-ET技术助孕。（2）排除标准：①子宫内膜异位症;②输卵管积水;③子宫肌瘤;④急性生殖道感染;⑤严重内外科疾病;⑥性激素应用禁忌证;⑦甲状腺功能异常;⑧夫妻双方有任何一方染色体异常。按激光辅助方式不同分为A组190例和B组149例。所有患者均签署知情同意书，本研究获得医学伦理委员会审批同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂、仪器与耗材 囊胚玻璃化冷冻试剂（RapidVit TM Blast， Vitrolife），囊胚玻璃化解冻试剂（RapidWarm TM Blast， Vitrolife），胚胎移植液（EmbryoGlue， Vitrolife），体视显微镜（SMZ800，日本Nikon），倒置显微镜及显微操作系统（英国RI），CO2培养箱（澳大利亚Cook），液氮罐（美国MVE），冷冻盒（瑞典Vitrolife），激光封口仪（瑞典Vitrolife），开放式载杆（日本Kitazato），激光破膜系统（英国RI）。

1.2.2 促排卵方案和胚胎培养 应用长方案促排卵，取卵后行常规IVF，37 ℃、三气培养箱内培养胚胎，第三天新鲜移植两枚卵裂胚或冷冻两枚卵裂胚，剩余可利用胚胎培养至第5～6天，养成的可利用囊胚行玻璃化冷冻。

1.2.3 囊胚质量评级及囊胚冷冻和解冻 根据David Gardner提出的囊胚分级系统分级对分级在CC以上的第5天或者第6天囊胚进行玻璃化冷冻。本中心定义2PN来源且3BB级以上囊胚为优质囊胚。在囊胚玻璃化冷冻前，先进行激光皱缩。囊胚冷冻过程：将囊胚在冷冻1液，冷冻稀释培养基[含10%血清蛋白替代物（SPS）的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）液]中放置10 min，随后转移至冷冻2液[1.5 M苯二胺（PPD）溶液]中2 min，在冷冻3液（1.5 M PPD溶液+0.1 M蔗糖溶液）中转移3个位置并在1 min内装载到加藤载杆的前端上，立刻将载杆叶片浸入液氮中，装好套管，把胚胎保存在液氮中。胚胎解冻过程为：将载杆从液氮中取出，放入解冻1液（0.5 M蔗糖解冻液）2 min中，再移至2液（0.2 M蔗糖解冻液）中3 min，3液[HEPES培养基（含10% SPS）]中10 min，移至G-2微滴皿中清洗最后放于移植皿。

1.2.4 子宫内膜准备 激素替代周期：月经第3天开始口服6～12 mg/d补佳乐，2周后行B超检查，待内膜≥8 mm时肌肉注射80 mg/d黄体酮，5 d后解冻。自然周期：出现黄体生成素（LH）峰，即LH半定量试纸测定达65 U/L，优势卵泡直径为16～18 mm，排卵日肌肉注射40 mg/d黄体酮，第5天行冻融胚胎移植。

1.2.5 辅助孵化 A组行透明带削薄：移植胚胎前，用激光系统（英国RI）薄化透明带，使用半环状薄化程序，对透明带1/4周长区域进行操作，时长根据需要选择1～1.4 ms，削薄透明带50%～80%。B组行透明带打孔：移植胚胎前，使用激光系统（英国RI）行透明带打孔，时长根据需要选择1～1.4 ms，在透明带上灼烧出透明带1/8～1/4周长区域孔洞，操作完成后应能明显观察到胚胎内外液体的流动。

1.2.6 胚胎移植 在B超引导下将辅助孵化后胚胎移植入宫腔，黄体功能用黄体酮或绒毛膜促性腺激素（hCG）维持。移植后5周，B超检查显示可见孕囊与原始心管搏动，即为妊娠。

1.3 观察指标 （1）比较两组胚胎复苏情况与胚胎情况，包括移植胚胎数、优质囊胚率、胚胎解冻复苏率;（2）比较两组移植情况，包括移植周期妊娠率、胚胎着床率、流产率、活产率;（3）统计比较两组子代出生情况，包括出生缺陷、早产情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 A组190例，年龄22～36岁，平均（31.23±2.45）岁;不孕年限1～9年，平均（4.15±1.20）年;移植日内膜厚度8～15 mm，平均（0.95±0.25）mm;子宫内膜准备：激素替代周期83例，自然周期107例。B组149例，年龄24～35岁，平均（31.17±2.29）岁;不孕年限2～10年，平均（4.26±1.05）年;移植日内膜厚度7～15 mm，平均（0.96±0.27）mm;子宫内膜准备：激素替代周期63例，自然周期86例。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组胚胎复苏情况与胚胎情况比较 A组移植胚胎数（1.52±0.50）个，与B组移植胚胎数（1.51±0.50）个比较，差异无统计学意义（t=0.183，P=0.855）。A组冻前胚胎279个，B组冻前胚胎234个。两组优质囊胚率、胚胎解冻复苏率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 两组移植情况比较 两组移植周期妊娠率、胚胎着床率、流产率、活产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.4 两组子代出生情况比较 两组子代出生缺陷率、早产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

囊胚评级、患者年龄、子宫内膜情况、移植胚胎数目与胚胎解冻复苏情况、临床妊娠情况密切相关。本研究选择年龄在37岁以内，行冻融囊胚解冻移植技术的患者按激光辅助孵化方式分组。两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），说明两组的一般情况基本一致。纳入研究周期的冷冻解冻过程由两名完成200次以上人类胚胎冷冻解冻临床操作经验的胚胎师随机操作。操作人员对载杆使用、试剂使用和标准化操作规程非常熟练并严格执行，尽量消除研究过程中的由操作人员引起的试验误差。

透明带可局部裂解，促使囊胚正常孵化、种植，而在体内小分子物质与动力学相关变化的相互作用下，囊胚可造成透明带逐渐扩张、變薄，并局部发生断裂、溶解，确保囊胚正常孵出和成功种植[6-10]，因在胚胎种植中透明带孵出起到重要作用。IVF-ET技术中，胚胎或卵子长期在体外培养基中暴露，移植后剩余的新鲜可利用胚胎需行冻融复苏，而暴露于液氮中，会造成透明带增厚、变硬，阻碍囊胚孵出，直接影响种植成功率[11-13]。辅助孵化技术是利用人为方式促进胚胎脱出透明带，从而提高胚胎种植成功率，促进患者妊娠。

激光辅助孵化具有定位准确、操作时间短、胚胎暴露于体外时间短、可重复使用、无须昂贵的操作仪器等优势，可有效降低辅助生殖周期成本，与其他孵化方式相比，是一个相对安全、有效的选择[14-15]。本研究结果显示，两组优质囊胚率、胚胎解冻复苏率、移植周期妊娠率、胚胎着床率、流产率、活产率、出生缺陷率、早产率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），提示囊胚透明带削薄、透明带打孔均是有效辅助孵化术方式，效果相当。透明带打孔直接将胚胎暴露于子宫环境，人为地干扰了胚胎的内环境，内膜和胚胎的分子交互影响可能会影响胚胎着床[16-17]。透明带削薄将液体通过显微镜传导至透明带，热效应溶解透明带，削薄透明带厚度的50%～80%，长度约为透明带1/4周长区域，无须穿透内侧透明带，最大程度减少了囊胚孵出阻力，同时维护了胚胎内环境的稳定[18-20]。因目前研究手段难以明确透明带上胚胎自然孵出位置，可将透明带薄化区域扩大，增加其与自然易孵出位点对应概率，为胚胎顺利孵出提供良好条件。胚胎发育至囊胚阶段后透明带已经比卵裂胚更薄。故两种辅助孵化方式对囊胚而言都能有效减少冷冻过程中透明带变硬带来的阻力。这两种激光孵化方式的作用效果可能被囊胚的高着床率和高妊娠率的特点掩盖而无明显差异。

综上所述，透明带削薄、透明带打孔均为有效的辅助孵化手段，两者在囊胚期冻融胚胎移植中效果相近，临床可根据患者具体情况和各实验室操作规程选择适宜的技术。

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（收稿日期：2020-05-11） （本文编辑：姬思雨）