IGF2/H19印记基因与男性不育症相关研究进展*

王 福张爱民杜冠潮赵 丰郭 俊晏 斌** 综述 郭 军**审校

1.中国中医科学院西苑医院（北京 100091）；2.陕西中医药大学附属医院（陕西咸阳 712000）

基因印记(genomic imprinting)是一种不同于经典孟得尔遗传定律的现象,指体细胞来源于不同亲代的一对等位基因发生的差异性表达；即机体仅表达来自亲本其中一方的基因,另一方不表达或较少表达，因而只继承母源或父源单方的遗传属性。如父源印记（paternal imprinting）是指父源等位基因不表达，仅仅母源基因表达，参与该遗传特性的基因被称为印记基因[1]。虽然此类基因在基因组中所占百分比较少，但其在生殖发育中发挥重要的作用。胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor-2，IGF2）和H19基因是其中具有代表性基因。两者定位相近，相互印记，拥有同一调控系统，一起调控人体的生长发育。近年来，随着科学研究的深入，国内外学者对IGF2和H19的印记调节机制进行了深入的研究，发现IGF2和H19的印记异常与男性不育症的发生有密切联系[2，3]，本文就此类相关研究最新进展综述如下。

一、IGF2/H19基因简介

IGF2为胚胎性生长因子，是分泌的小蛋白质，是一种非常强的有丝分裂原，不受生长激素的调控；其调控诸多生理过程，可促进多种细胞增殖和分化。IGF2基因定位于人体染色体11pl5.5，鼠体7号染色体远端，是最早发现的内源性印记基因，属于母源性印记基因，父方表达[4]。在小鼠IGF2基因敲除实验中，若敲除的等位基因来自母方，则小鼠的生长发育没有明显变化，若敲除的IGF2等位基因来自父方，则小鼠相对较小，生长发育受到限制[5]。一般来说，IGF2的表达常常在出生后受到抑制，出生后IGF2主要通过自分泌和旁分泌机制促进局部组织的生长。

H19基因作为一种生长调节基因，在细胞的增殖和分化两方面具有双重作用，具有一定选择表达，在人和鼠的胚胎组织中高度表达。这种现象体现在成人中主要表达部位是骨骼肌、心肌、乳腺等。H19基因位于人体11pl5.5，鼠体7号染色体远端，与IGF2基因相距仅70kb处，为一单拷贝基因，因其与IGF2基因的连锁交互性而常放在一起进行研究。与IGF2不同的是，H19基因属父源性印记基因，母源表达，其只在mRNA水平上发挥作用，最终的表达产物为RNA，不具备表达蛋白质的功能[6]。但与IGF2相同的是，H19基因的表达也在机体出生后明显受到抑制。

二、IGF2/H19基因印记机制

（一）增强子竞争学说

国外学者提出了增强子竞争学说[7]；该学说认为IGF2/H19基因共享H19基因下游位置的增强子（Enhancer）；在父源染色体，H19上游的高度甲基化以及猜想中的染色体闭合结构增强子不能作用于H19，使得IGF2激活进而表达；在母源染色体上，由于增强子离H19较近，与H19的亲和力更高，使得IGF2沉寂或极少表达，从而激活H19，使之得以表达（见图1）。

该学说的主要贡献是通过研究得出H19、IGF2共用一套增强子的结论，奠定了研究H19、IGF2的印记机制的理论基础。但该学说也有一定的局限性，如对增强子如何选择IGF2/H19基因的确切机制，并未做出具有高度说服力的解释等。

图1 IGF2/H19基因调控模式图[8]

（二）CTCF绝缘子学说

根据增强子竞争理论，甲基化使父源H19及母源IGF2保持沉默。尚未明确指出母源IGF2启动子并未甲基化的原因，根据相关的研究发现，位于H19上游2kb存在差异甲基化区域 (differentially methylated domain，DMD)。DMD即精子与卵子对同一基因具有不同程度的甲基化水平。这个区域有绝缘子(insulator)功能，甲基化控制绝缘子的活动，而DNA甲基化是通过控制CTCF绝缘子蛋白(结合DMD的复合体)起作用的，这是研究H19和IGF2印记机制的突破性进展。

对IGF2/H19基因而言，在父源等位基因上，H19上游及其启动子CpG岛呈甲基化状态；在母源等位基因上，呈现去甲基化状态，未甲基化的DMD内绝缘子序列可与CTCF结合形成绝缘子 (CTCF复合体)阻止IGF2基因与其下方增强子相互作用，结果只有H19基因表达。在父源染色体上，DMD内CpG岛甲基化导致无法与CTCF结合，从而H19基因下方增强子可以激活IGF2基因启动子，IGF2基因得以表达；与此同时由于H19启动子甲基化而保持不表达[9]。可见，DMD在IGF2/H19的印记机制中起了最为关键的作用，有学者将此区域亦称为DMR(differentially methylated region)或印记控制区(imprinting control region，ICR)[10,11]。

（三）其他学说

此外，部分学者还提出了关于IGF2/H19的印记机制的染色质构型学说、转录周期学说等相关学说[12，13]。

IGF2/H19基因位于同一印记区域，两者紧密相连、相互印记。虽然增强子竞争学说及DMD共同调控印记基因IGF2/H19表达是目前较为认同的主要学说，但仍未形成公认。学术界普遍认为IGF2/H19基因的调控机制绝不是单一因素的作用，而应是一个非常复杂的调控系统。

三、IGF2/H19基因与男性不育症

大量研究表明男性不育症的发生与IGF2/H19基因表达密切相关。其主要方式是印记松驰(relaxation of imprinting,ROI)，即处于印记状态的基因重新表达从而引起一系列的生理、病理改变，也有学者称为印记丢失（loss of imprinting ，LOI）[14]。

（一）少精子症

据Marques CJ等学者[15]研究发现，H19基因的异常甲基化对于男性不育症的影响主要是影响精子的发生，导致少精子症。对IGF2/H19基因上47个CpG位点的甲基化进行检测，精子浓度在20×106／mL以上的男性表现为正常的甲基化水平，其他男性不育症患者呈现异常甲基化；而精子浓度低于10×106／mL的男性不育症患者则表现为IGF2-DMD和H19-DMD位点甲基丢失严重；该研究表明，H19的异常甲基化与精子发生密切相关。国外另外一篇研究也得出类似的结论，该研究观察了148名特发性男性不育症患者以及33名精液正常的对照组IGF2/H19甲基化水平，研究发现对照组IGF2/H19甲基化水平很高。[16]

国内研究也可得出类似研究结果，李建波等[17]通过排除染色体核型分析和Y染色体微缺失等因素干扰，纳入18例少精子症患者(精子浓度＜15×106/mL，其余指标均正常)、20例弱精子症患者 (前向运动精子百分率＜32%，其余指标均正常)，结果显示与对照组（20例正常生育男性）甲基化丢失率[(0.30±0.06%]相比，少精子症患者的H19印记控制区域的LOI显著增加[(9.19±2.45)%]，甚至当精子浓度＜3×106/mL时，差异达到极显著水平(P＜0.01)。另外，有研究发现在无精子症患者中，IGF2基因在睾丸组织中LOI高达52%[18]。

（二）弱精子症

与IGF2/H19甲基化异常同精子发生异常密切相关的结论相比，其与弱精子症的相关性存在争议；董浩等[19]研究发现少精子症和弱精子症H19甲基化水平分别是［(75.04±15.35)%］、［(79.48±11.64)%］，均显著低于正常对照组［(89.10±11.23)%］，差异具有统计学意义；证实了IGF2/H19甲基化异常除了与少精子症有关，与弱精子症也有密切的联系；但是李建波[17]的相关研究则提示弱精子症患者H19印记控制区域的DNA甲基化丢失程度与对照组无显著差异。

（三）畸形精子症

畸形精子症与IGF2/H19基因甲基化异常的相关性研究，目前也存在争议。国外学者发现正常男性精液中的CpG岛都呈现高甲基化水平，而在19个畸形精子症患者中，11人在IGF2 DMR和H19 DMR中的多个CpG位点发生去甲基化，畸形精子症患者H19表现出多个CpG岛低甲基化，该研究证实畸形精子症可能与IGF2/H19 ICR低甲基化有关[20]。然而董浩等[19]研究发现，畸形精子症组中的印记基因H19甲基化水平(87.82±12.10)%与正常对照组(89.10±11.23)%的差异无统计学意义。

综上，弱精子症、畸形精子症与IGF2/H19的相关性存在争议，可能跟弱精子症、畸形精子症检测方法及标准不一致，与样本量、甲基化检测方法、种族、地区等相关，弱精子症、畸形精子症与H19甲基化异常的相关性需要进一步研究。

四、中医药干预IGF2/H19基因表达

随着IGF2/H19基因与疾病的相关性受到医学界广泛关注，其研究相关的思路与技术已逐渐应用到中医药研究中。近年来，中医药研究主要集中在以下2个方面：（1）IGF2/H19基因甲基化程度的治疗前后变化；（2）中医药治疗对甲基化相关酶的影响。

中医药治疗男性不育症，特别是特发性不育症方面，疗效显著，机制复杂[21,22]；但目前国内已有学者关注中药治疗男性不育症前后IGF2/H19基因表达。研究发现，印记基因H19在肾阳亏虚证类患者的体内表达出现异常，通过补益肾气的方法予以治疗可使H19的表达状态得到明显改善。临床对比显示，补肾中药生精方治疗肾阳虚患者3个月后，精子密度、（a+b）级精子均较治疗前有明显改善，且治疗效果明显优于对照组；同时，患者的精子H19基因印记丢失率较治疗前显著降低，由 14.71%（5/34）降至 2.94%(1/34)；此类研究可证明补益肾气中药的作用机理与改善精子DNA印记基因H19表达具有相关性[23]。

五、讨论

关于印记基因的DNA甲基化状态与精液质量关系的研究已然成为生殖领域的热门研究方向[24]。IGF2和H19作为较早发现的此类基因代表，其印记异常与男性不育症的发生以及患者病情的发展密切相关。因此，深入研究IGF2/H19基因印记与精子的发生、成熟之间的关系，可能会为男性不育症的诊断提供新的思路；同时通过更深层次的研究印记基因的DNA甲基化机制，将为男性不育症的发病机制研究和临床治疗提供新的发展方向。