四君子汤对脾虚模型大鼠肽转运载体1转运功能及其基因表达的影响*

杭州市中医院 浙江 杭州 310007

肽转运载体1（PepT1）主要表达于小肠刷状缘膜上,是蛋白质消化产物小分子肽（二肽、三肽）在小肠吸收的主要转运体。因此，PepT1的表达和功能直接影响蛋白质消化产物的吸收水平[1-3]。PepT1的底物很多，以β-内酰氨类抗生素头孢羟氨苄（Cefadroxil）最为常用，PepT1对头孢羟氨苄具有与二肽、三肽相同的底物特异性。即头孢羟氨苄在肠道内的吸收机理与二肽一样，均是通过 PepT1转运，而且头孢羟氨苄在肠道吸收后由于缺乏相应的降解酶而几乎不被降解［4-5］，因此，许多关于PepT1的研究都以头孢羟氨苄为底物［6-7］。

四君子汤由人参、炙甘草、茯苓和白术4味药物组成，其主要功用是健脾益气，常用于治疗脾胃虚弱、运化无力等症，为治疗脾虚证的基础方。本研究以头孢羟氨苄为PepT1的底物，研究了脾虚模型大鼠服用四君子汤对PEPT1的表达和功能的影响。通过测定四君子汤对PepT1转运功能及蛋白、mRNA表达、底物的血药浓度的影响，以期为科学指导临床中西药合理联药提供理论依据。

1 材料

1.1 药品：党参、白术、茯苓、甘草购自浙江中医药大学中药饮片厂。以上四味药材按3∶3∶3∶2的比例混合后，加10倍量水煎煮2次，每次1小时，合并滤液后浓缩，冷藏过夜，离心，取上清液稀释至2g药材/ml，作为四君子汤药液。

1.2 仪器与试剂：安捷伦高效液相色谱仪（Agilent 1200）；台式高速冷冻型微量离心机（D3024R，Dragon‐Lab）；荧光定量PCR仪（Stepone plus，ABI）；超微量分光光度计（NanoDrop2000，Thermo）；利血平（Reserpine,Sigma,Lot WXBC4865V）；PepT1抗体（ABACM，Ab203043）；头孢羟氨苄标准品cefadroxil（中国食品药品检定研究院，130431-201203）；头孢羟氨苄片(清远华能制药有限公司，20161016)。

2 方法

2.1 动物分组及给药：将SD雄性大鼠50只（体重200g左右）随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，高、中、低剂量治疗组。正常对照组每日股四头肌注射生理盐水0.1ml/只，连续14天，并于当天灌服生理盐水2ml/只，连续14天。模型组和三组治疗组每日股四头肌注射利血平注射液0.5ml/Kg，连续14天，建立脾虚模型。模型组在造模当天灌服生理盐水2ml/只，连续14天。高中低剂量组在造模当天分别灌服四君子汤药液2ml、1ml、0.5ml/100g，连续14天。第15天禁食后每组大鼠灌服头孢羟氨苄200mg/Kg，于给药后0.5、1、1.5、2、4h、6h、8h眼眶取血，肝素抗凝管制备血浆，-80℃保存备用。处死大鼠，立即取十二指肠下15cm处小肠段5cm，DEPC处理水清洗3次后冰上刮取黏膜，放入冻存管中液氮保存，用于PepT1 mRNA检测；在幽门下20cm处剪取小肠段2cm，冰生理盐水清洗后中性甲醛固定20h，用于PepT1蛋白免疫组化检测。

2.2 头孢羟氨苄吸收的测定：分述如下。

2.2.1 色谱条件：色谱柱（Agilent XDB-C18 150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇：水（含0.01M磷酸二氢钠）＝13∶87（V∶V）；检测波长：260nm；柱温：35℃；流速：1ml·min-1；进样量20μl。

2.2.2 样品制备：精密量取血浆0.1ml，加入0.1ml 6%高氯酸溶液，震荡1min，低温离心5min（12000rpm），取上清液即为供试品溶液。

2.2.3 线性关系的考察：将一定量的头孢羟氨苄标准品溶解于一定量的蒸馏水中，配成8种浓度的标准溶液。精密吸取空白血浆90μl，加入以上标准溶液10μl，按“2.2.2”的方法操作后进行样品分析，设进样浓度值为X，峰面积值为Y，用加权（W=1/C2）最小二乘法进行回归运算，得线性回归方程：Y＝0.1137X-4.0078，r＝0.9997，线性范围0.6375-81.6μg•ml-1，最低检出浓度为：0.6375μg•ml-1（以S/N≥3计）。

2.2.4 精密度：低、中、高按浓度样品的日内精密度RSD为1.35%、0.98%、1.09%，日间精密度RSD为1.79%、1.52%、1.45%，精密度达到分析要求。

2.2.5 重复性：取同一血浆样品，按“2.2.2”项下操作，平行操作5次，得5份供试品溶液，在“2.2.1”条件下进行含量测定，RSD小于5%。

2.2.6 加样回收率：精密量取已知浓度的血浆样品90μl，共9份，每3份为一水平，分别精密加入头孢羟氨苄标准溶液102、204、408μg•ml-110μl，按“2.2.2”项下操作，在“2.2.1”色谱条件下进行分析，平均回收率为94.75%，RSD为3.63%。

2.3 小肠黏膜PepT1表达的影响：采用免疫组织化学法，按照试剂盒说明书步骤进行免疫组化染色。显示苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的PEPT1阳性表达为棕黄色。每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度值（average optical,AO值），AO=IOD/AREA，AO值越大表明阳性表达水平越高。

2.4 小肠黏膜PepT1mRNA表达的检测：应用荧光定量PCR法对小肠黏膜 PepT1 mRNA表达进行定量。取小肠黏膜用Trizol法提取总RNA后逆转录为CDNA，按照实时定量PCR试剂盒的说明书进行操作，检测PepT1的mRNA表达水平，引物序列见表1。扩增程序为预变性，95℃，10min；循环（40次），95℃，15s→60℃，60s；熔解曲线，60℃→95℃，每15s升温0.3℃。以GAPDH为内参，实验重复3次，采用2一△△CT法进行数据的相对定量分析。

表1 PCR引物

3 结果

3.1 血浆头孢羟氨苄浓度经时变化：各组大鼠灌服头孢羟氨苄30min后，血中即可检测到较高浓度的头孢羟氨苄，达峰时间在1h左右。0～4h，与正常组相比，模型组血药浓度明显增加（P＜0.01）；用药后，高剂量组和中剂量组血药浓度与模型组相比显著下降（P＜0.01），与正常组接近；低剂量组无明显变化。见图1。

图1 各组平均血药浓度-时间曲线

3.2 四君子汤对小肠黏膜PepT1表达的影响：模型组大鼠PepT1蛋白表达与正常组比较，呈明显上调（P＜0.01）。与模型组比较，四君子汤高剂量组和中剂量组蛋白表达显著下降(P＜0.01),其中高剂量组与正常组接近（P＞0.05）；低剂量组与模型组相比，蛋白表达也下调，但无显著性差异（P＞0.05）。见表2、图2。

表2 四君子汤对大鼠小肠上皮PepT1表达的影响（±s，n=10）

表2 四君子汤对大鼠小肠上皮PepT1表达的影响（±s，n=10）

注：与正常组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

AO值0.004030±0.001031 0.1165±0.002442△△0.004827±0.001083**0.006381±0.0009205**0.009401±0.002531组别正常组模型组高剂量组中剂量组低剂量组

图2 免疫组化方法测定小肠黏膜PepT1表达

3.3 四君子汤对大鼠小肠黏膜PepT1 mRNA表达的影响：应用荧光定量PCR法对小肠黏膜 PepT1 mRNA表达进行定量，模型组大鼠PepT1 mRNA表达量相对于正常组略有升高，但无显著性差异（P＞0.05）；用药之后，四君子汤高、中、低剂量组大鼠PepT1 mRNA表达量相对于模型组略有升高，但无显著性差异（P＞0.05），相对于正常组都有升高，高、中剂量组有显著性差异（P＜0.01，P＜0.05）。

图3 PCR法测定小肠黏膜PepT1 mRNA结果

4 讨论

脾虚状态下，脾主运化功能障碍，小肠对营养物质的吸收转运功能降低，但是本实验中脾阳虚模型组大鼠头孢羟氨苄的血药浓度与正常组比较显著性升高，模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞刷状膜囊缘上PepT1阳性表达比正常组显著增加。有研究认为，在小肠吸收功能出现障碍或整体蛋白质营养吸收低下的情况下，二肽转运比氨基酸转运更有效[8]。实验结果与文献报道一致，可以理解为在脾虚状态下，小肠对二肽吸收转运的增加是一种病理状态下的应激反应，是对小肠氨基酸转运不足而造成的营养不良的一种代偿状态。与模型组比较治疗后高剂量组和中剂量组蛋白表达显著下降(P＜0.01)，对二肽的吸收减少，因此头孢羟氨苄的血药浓度下降，高剂量组与正常组接近（P＞0.05），而低剂量组相对模型组无明显变化，说明在本实验中，四君子汤可使脾虚大鼠异常升高的Pep T1蛋白表达趋于正常，且呈剂量依赖性。

本试验中模型组PepT1阳性表达增加了，但PepT1的mRNA水平并没有显著升高。有报道小肠黏膜上皮细胞刷状膜囊缘上PepT1蛋白才是具有转运活性的功能蛋白，在细胞池内还存在不具有转运活性的PepT1蛋白[9]。有研究发现用TNF-α，IFN-γ等炎症因子处理后PepT1表达增加，但是PepT1 mRNA并没有增加，提示细胞膜上PepT1蛋白表达的增加是转录后变化[10]。通过本实验，初步可以得出，用药后小肠黏膜上皮细胞刷状膜囊缘上PepT1蛋白表达的增加，只是促进了转运载体从细胞池到细胞膜上的移位增加，而不是从头合成增加。