布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)信号通路与疾病

陈潇，龚国清

(中国药科大学药理学研究室，江苏 南京 211198)

生化分析和体内基因靶向实验已经暗示酪氨酸激酶是B细胞发育和功能中细胞分化，增殖，存活和迁移的关键调节剂。其中一种，布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)，在人类的原发性免疫缺陷X连锁性丙种球蛋白血症(XLA)和小鼠的X连锁免疫缺陷(Xid)中发生突变。XLA和Xid的特征在于分别在前B细胞阶段几乎完全阻止B细胞发育和成熟B细胞的分化缺陷[1-2]。自1993年鉴定BTK作为该疾病的缺陷基因以来，我们对其发病机制的认识已经大大深入。在其发现后不久，证明了BTK在成熟B细胞中与B细胞受体(BCR)信号传导密切相关。

除T细胞和NK细胞外，BTK几乎在造血系统的所有细胞中表达，并且还参与B细胞中的许多其他信号传导途径，包括Toll样受体(TLR)和趋化因子和Fc受体信号传导。在BTK被成功鉴别后，很快BTK小分子抑制剂便被开发出来，并且在体外白血病细胞中显示出具有抗肿瘤活性[3]。2007年，一种不可逆BTK抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib,代号PCI-32765)的发现[4]，是抑制B细胞恶性肿瘤中的信号转导治疗的里程碑。

依鲁替尼在2013年被美国食品药品监督管理局(FDA)批准为用于治疗套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)[5]，2015年，获得FDA和欧洲药品管理局(EMA)的批准，用于治疗有症状的Waldenström巨球蛋白血症(WM)患者[6]。临床前研究以及临床试验现已提供证据表明BTK抑制剂的抗肿瘤活性在很大程度上取决于其在BCR信号传导之外的作用，例如B细胞中的趋化因子和TLR信号传导或骨髓微环境中破骨细胞或其他细胞产生肿瘤支持因子[7]。

此外，小鼠中的各种研究证明了适当调节BTK活性的至关重要性。例如，B细胞中BTK的转基因过表达与自发生发中心(GC)形成，自身抗体产生和系统性红斑狼疮(SLE)样自身免疫病理学相关[8]。相反，在患有胶原诱导的关节炎(CIA)的小鼠中或在患有SLE样疾病的小鼠中的依鲁替尼治疗降低了自身免疫症状[9-10]。

在这篇综述中，我们讨论了BTK在BCR信号传导途径与其他信号通路中的功能，以及BTK缺陷对正常生理功能造成的影响与BTK抑制对疾病的治疗意义。

1 BTK结构与BCR信号

1.1 BTK的结构与活性调节 BTK是由659个氨基酸组成的蛋白质，与在肝细胞癌中表达的酪氨酸激酶(TEC)、诱导型T细胞激酶(ITK)、静息淋巴细胞激酶(RLK)和骨髓表达激酶(BMX)4个成员一起，属于非受体酪氨酸激酶的Tec家族，在整个进化过程中都非常保守，高度表达于造血细胞[11]。

BTK的结构域结构类似于SRC家族激酶的结构域结构，并且它包含SRC同源结构域(SH结构域)SH2和SH3，以及催化结构域。然而，与SRC家族激酶不同，BTK具有氨基末端的pleckstrin同源(PH)结构域和富含脯氨酸的TEC同源(TH)结构域，其含有锌指基序，这对于最佳活性和稳定性是重要的[12]。SRC家族激酶组成性地与膜结合，而BTK在细胞质中，并且仅会在其PH结构域与由PI3K产生的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)结合时短暂地募集到膜上[13]。

在B细胞中，BTK活化由PH结构域介导的质膜结合引发，其能够通过脾酪氨酸激酶(SYK)或SRC家族激酶如LYN在激酶结构域的残基Y551处磷酸化。这促进了BTK的催化活性，并导致其在SH3结构域中的位置Y223处的自身磷酸化[13-14]。B细胞谱系中Y223F-BTK的转基因表达基本上校正了BTK缺陷Xid小鼠的表型[15]，证明了在体内前B细胞或B细胞中BTK功能不需要Y223F自磷酸化。因此，SH3结构域，特别是SH3结构域Y223自身磷酸化位点的功能意义仍不清楚，Y223的磷酸化似乎不影响BTK活性[15]。在BCR刺激后，成熟B细胞中BTK水平增加，但所涉及的转录后机制十分复杂，并且至今为止仅有部分得到研究证实。包括microRNA-185(miR-185)调节BTK表达[16]，BCR与Toll样受体(TLR)相互作用，BTK通过涉及核因子-κB(NF-κB)的途径刺激其自身启动子的转录，启动蛋白酶体依赖性阳性自动调节反馈环[17-18]。

1.2 BCR信号激活BTK BCR复合物与二硫键连接的Igα-Igβ异二聚体非共价结合。在抗原与BCR结合后，SRC家族蛋白酪氨酸激酶LYN磷酸化Igα和Igβ免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，从而产生SYK的停靠位点[19]。同时，LYN磷酸化BCR共受体CD19的细胞质尾部中的酪氨酸残基，这使得能够结合和激活PI3K和VAV[20]。除了CD19，用于PI3K的细胞质B细胞衔接子也可以募集PI3K并激活。PI3K产生PIP3，其是用于激活下游途径的重要第二信使。PI3K通过PIP3-PH结构域相互作用将BTK吸引至细胞膜，其允许SYK和LYN通过Y551的反式磷酸化完全激活BTK[21]。BTK活化可以通过磷酸酶PTEN和含有SH2结构域的肌醇5′磷酸酶1(SHIP1)调节，其使PIP3去磷酸化从而抑制BTK膜结合。一旦SYK被激活，通过募集和磷酸化65kDa的含有SH2结构域的白细胞蛋白(SLP65)将信号传导至下游效应子，其作为各种信号分子的支架，包括SYK、BTK及其关键底物磷脂酶C-γ2(PLCγ2)[22]。

1.3 BTK的下游信号传导 SLP65介导的BTK和PLCγ2的募集完成了所谓的微信号体的形成，其包括VAV，PI3K，BTK，SLP65和PLCγ2。BTK主要负责Y753和Y759位置的PLCγ2磷酸化，这对PLCγ2的脂肪酶活性至关重要[23]。此外，BTK不依赖于其激酶活性，可以募集磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)，从而刺激产生磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)的正反馈环，PIP2可作为PI3K和PLCγ2的底物[24]。

被BTK活化后，PLCγ2切割PIP2以产生两个第二信使，肌醇三磷酸(iIP3)和二酰基甘油(DAG)，其激活分叉和部分重叠的信号传导途径[25]。DAG介导蛋白激酶C(PKC)β的激活，其诱导细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2的RAS信号传导依赖性磷酸化。与ERK1和ERK2不同，其他丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)如p38，可由PLCγ2诱导，无须通过RAS进行中间信号传导[26]。重要的是，PKCβ还通过支架复合物激活NF-κB途径，该支架复合物包括含有半胱天冬酶募集结构域的蛋白11(CARD11)，BCL10和黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1(MALT1)[27]。

1.4 BTK在pre-BCR信号传导中的作用 由于人类pre-BCR结合后形成由酪氨酸磷酸化的LYN、SYK、SLP65、PI3K、BTK、VAV和PLCγ2组成的筏相关Ca2+信号传导模块，所以可以假设由pre-BCR和BCR介导的信号通路是相似的[28]。在小鼠中，在pre-BCR信号在功能上与白细胞介素7受体(IL-7R)信号传导途径相互作用，除了Janus激酶3(JAK3)-信号转导和转录激活因子5(STAT5)信号传导之外，它还激活SRC家族激酶和ERK途径。IL-7R和pre-BCR信号传导协同诱导前B细胞的增殖[29]。

缺乏关键的pre-BCR分子的小鼠，例如SYK、SLP65、BTK和PLCγ2，仅在前B细胞阶段显示出一些发育阻滞。SLP 65缺陷的白血病前B细胞在细胞表面表达高水平的pre-BCR，但这不可能有助于它们在体内的强增殖能力，因为SLC的转基因过表达不诱导或增加白血病的发展[30]。在正常的前B细胞中，SLP65通过直接抑制JAK3-STAT5信号传导途径下调IL-7介导的前B细胞增殖和存活[31]。Btk缺陷型小鼠不会发生前B细胞白血病，然而，与其激酶活性无关，BTK确实与SLP65合作调节IL-7介导的前B细胞增殖和存活，这表明BTK可以作为肿瘤抑制剂起作用[32]。

2 BTK在其他信号通路中的作用

2.1 BTK与趋化因子受体信号传导 生化分析和体外黏附和迁移测定已经确定BTK参与趋化因子受体途径，其对于B细胞运输，组织归巢和体内平衡是必需的。BTK是趋化因子受体CXCR4和CXCR5的关键信号传导因子[33]。由骨髓和生发中心的基质细胞高度表达的CXC-趋化因子配体12(CXCL12)诱导BTK活化，最可能是通过BTK和CXCR4连接的异源三聚体G蛋白亚基之间的直接相互作用。Gα和Gβγ亚基都可以直接结合BTK的PH结构域和相邻的TH结构域。因为在缺乏LYN或SYK的B细胞中发现CXCL12控制的迁移减少，所以可以推测这些激酶在CXCR4连接后激活BTK[34]。在SYK抑制剂的存在下，在Y551诱导CXCL12诱导BTK磷酸化的发现证实了这一点。在体外实验中，依鲁替尼可以抑制MCL和CLL细胞中CXCL12诱导和CXCL13诱导的PLCγ2、ERK1、ERK2、JNK和AKT的磷酸化，以及细胞黏附和迁移，这与BTK在趋化因子受体信号传导中起关键作用的观点一致[35]。BTK在体内趋化因子信号传导中的作用首先通过小鼠中BTK缺陷型B细胞的过继转移实验证明，其显示B细胞归巢至淋巴结特别受影响[34]。

2.2 BTK和TLR信号通路 BTK在TLR信号中的作用首先通过发现BTK缺陷型B细胞的增殖响应于TLR4配体细菌脂多糖(LPS)而降低。TLR信号传导诱导下游转录因子NF-κB，激活蛋白1(AP1)和干扰素调节因子3(IRF3)其在B细胞中导致活化标志物的上调、增殖、抗体分泌、类别转换重组和产生促炎细胞因子。BTK可与大多数TLR的细胞质Toll/IL-1受体(TIR)结构域以及下游衔接子MyD88，TRIF和MyD88衔接子样蛋白(MAL)和IL-1R相关激酶1(IRAK1)直接相互作用[36]。TLR9和BCR刺激可以协同诱导IL-6的产生，因此BTK是自噬体样区室中TLR9和BCR共定位所必需的。由于BCR信号传导在细胞表面开始并且当其传递至细胞内区室时继续激活MAPK，可以推测TLR和BCR信号传导通过BTK互连[37]。

3 BTK缺陷病

3.1 X连锁无丙种球蛋白血症(XLA) XLA是原发性免疫缺陷病(PIDs)的遗传形式之一。它是由BTK基因突变引起的，导致骨髓内B细胞的发育和成熟缺陷，外周血中成熟B细胞显著减少或完全缺失。XLA患者中的前B细胞体积小，与BTK在诱导或其增殖中的基本功能一致[38-39]。由于缺乏成熟的B细胞，XLA患者血清中所有主要免疫球蛋白(Ig)的水平显著降低，因此会遭受严重和慢性细菌感染。XLA患者在其循环中具有<1%的正常B细胞数量，导致明显缺乏浆细胞，因此外周血中所有亚类的Igs水平非常低[40]。Mirsafian等[41]利用深度高通量RNA测序(RNA-Seq)方法，发现BTK突变可能导致先天免疫系统的失调，并增加XLA患者单核细胞中细胞凋亡的易感性。通过分析该疾病的雌性携带者中循环B细胞的X染色体失活状态，显示XLA的发育缺陷是B细胞谱系固有的。载体表现出突变体BTK基因对X染色体的单侧失活，表明在活性X染色体上具有缺陷BTK等位基因的B谱系细胞具有选择性缺陷。因此，XLA的女性携带者是健康的并且没有表现出免疫异常[42-43]。

在母体给予的Ig消失后，男孩患者通常在上呼吸道或下呼吸道中出现严重或复发的包囊细菌感染，主要是中耳炎、鼻窦炎和肺炎，少部分会患脑膜炎[44-45]。病毒感染通常不会引起XLA的异常问题，因为T细胞和NK细胞功能正常。XLA患者终生且完全依赖抗生素和静脉或皮下Ig替代疗法[46]。

3.2 小鼠的X连锁免疫缺陷(Xid) Xid 表型的CBA/N小鼠的免疫缺陷是由单个保守蛋白酪氨酸激酶BTK结构改变引起的遗传疾病，其特征是骨髓中B细胞发育前的部分阻断，外周成熟B细胞数量的中度减少，淋巴器官IgM和IgG3的循环抗体滴度低[47]。与XLA相反，表达R28C-BTK突变的Xid小鼠或在BTK基因中具有靶向破坏的小鼠仅表现出轻度B细胞病症。与野生型小鼠的B细胞相比， BTK缺陷型小鼠中的外周B细胞具有明显的存活劣势[48-49]。BTK缺陷型小鼠对T细胞非依赖性Ⅱ型抗原无反应，与野生型同窝小鼠相比，抗原特异性血清IgM和IgG3水平显著降低，对T细胞依赖性抗原的初级反应也受到损害[50]。

Xid小鼠对PR8流感感染的免疫反应相对正常。X-31流感病毒鼻内感染BTK缺陷小鼠和同窝野生型小鼠，发现二者病毒清除率相当。在流感感染后，野生型小鼠的肺中B-1细胞数量增加，而在幼稚BTK缺陷小鼠中，肺和胸膜腔中不存在B-1细胞，并且在流感感染后不诱导B-1细胞[51]。

BTK缺陷的Xid表型还可导致对各种病原体的易感性降低，与WT对照相比，感染肺炎支原体的Xid小鼠显示出存活率增加和组织损伤减少，可能是因为它们未能产生破坏性抗原-抗体反应[52]。

4 BTK抑制对疾病的治疗

4.1 Waldenström巨球蛋白血症(WM) WM以其发现者命名，是一种罕见的淋巴增生性疾病，其特征是骨髓和其他器官中淋巴浆细胞淋巴瘤细胞的恶性积聚，以及血清中单克隆IgM副蛋白的存在[53]。WM是一种异质性疾病，可出现血细胞减少、淋巴结肿大、肝脾肿大、高粘血症、神经病变、冷球蛋白血症或淀粉样变性。尽管WM患者往往存活数年，甚至数十年，病情无法治愈，并且绝大多数患者的疾病过程表现为影响患者生活质量和日常生活活动的症状性疾病复发[54]。

在WM患者中，MyD88中常见的L265P点突变导致MyD88的组成型活性形式，且BTK也具有诱导活性，尽管所涉及的机制仍不清楚。最近显示MyD88L265P与WM细胞中的磷酸化BTK结合，这表明BTK可能在这些细胞中的MyD88L265P中具有直接作用[55]。

依鲁替尼治疗WM细胞可消除MyD88L265P-BTK相关性并降低NF-κB活化。在两种WM细胞系和原代WM细胞中，当IRAK1和IRAK4也被抑制时，依鲁替尼诱导细胞凋亡并增加细胞凋亡水平。因此，依鲁替尼治疗MyD88L265P突变WM细胞的功效可能完全依赖于NF-κB活化的消除[56]。

4.2 慢性淋巴细胞白血病(CLL) CLL的特征在于血液中非增殖性单克隆CD5+成熟B细胞的积累。CLL B细胞通常具有低表面IgM表达并显示对BCR连接的无反应性反应，这表明慢性BCR内化和信号转导[57]。一些发现表明BTK信号传导基本上有助于CLL的启动或维持。在CLL小鼠模型中，BTK缺乏使肿瘤形成消失，而转基因BTK过表达增加肿瘤发生率和总体死亡率[8]。体外用依鲁替尼治疗，可以减少CLL细胞的存活和增殖，消除了BCR刺激的AKT和ERK磷酸化，以及VCAM1介导的黏附和淋巴细胞胞质蛋白1(LCP1)的表达，是F肌动蛋白交联分子，对CXCL12介导的迁移至关重要[35]。

BTK的抑制干扰多种途径，这些途径对于CLL细胞存活，增殖和体内迁移可能是重要的。BTK信号传导可能支持CLL细胞向淋巴结中的增殖中心迁移，因为体外伊布鲁尼治疗CLL细胞有效阻断CXCL12诱导的和CXCL13诱导的迁移。此外，当与B细胞激活因子(BAFF)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6、IL-4和CD40L一起培养时，依鲁替尼处理的CLL细胞在体外显示出降低的活力，这表明BTK抑制可能抵消促存活因子在CLL微环境中的作用。当CLL细胞与护士细胞(NLCs)共培养时，CLL细胞存活，增殖和CCL3和CCL4产生的减少也表明了破坏淋巴结微环境中共刺激反馈的可能性[58]。

4.3 套细胞淋巴瘤(MCL) MCL显著偏向的BCR谱表表明抗原刺激在其发病过程中起着至关重要的作用，但所涉及的抗原是未知的。在有限的患者组中观察到LYN、SLP65、SYK和PKCβ的组成型磷酸化，提示BCR信号传导的促存活作用。此外，发现SYK基因和SYK蛋白过表达，并且MCL细胞显示NF-κB和AKT的组成性激活，这可能反映BCR或TLR信号的激活[59]。BTK在MCL中显示出高表达，并且在未刺激的原代MCL细胞中观察到Y223处的BTK自身磷酸化增加。依鲁替尼治疗原代MCL细胞或细胞系导致活力降低，以及在BCR活化或响应CXCR4或CXCR5时黏连和迁移受损。接受间歇性或连续依鲁替尼治疗的MCL患者分别有复发性淋巴细胞增多症或单次淋巴细胞增多症[60]。

4.4 多发性骨髓瘤 多发性骨髓瘤细胞来源于不再在其细胞表面表达BCR的浆细胞。为了存活和增殖，多发性骨髓瘤细胞似乎依赖于由增加的破骨细胞活性和骨重建产生的信号。骨髓基质细胞，破骨细胞和成骨细胞为多发性骨髓瘤细胞提供关键的激活和归巢信号，例如增殖诱导配体(APRIL)、IL-6和CXCL12[61]。

在小鼠中，BTK和TEC对于成骨细胞形成是必不可少的，其由NF-κB配体的受体活化剂(RANKL)诱导。与此观察结果一致，依鲁替尼阻断RANKL诱导的BTK和下游PLCγ2的磷酸化，并通过骨吸收活性测量体外抑制人破骨细胞功能。在来自患有多发性骨髓瘤的患者的破骨细胞或骨髓基质细胞中，依鲁替尼下调肿瘤支持因子的产生，包括CCL3、转化生长因子β、APRIL和CXCL12。依鲁替尼阻断了CXCL12诱导的多发性骨髓瘤细胞的黏附和迁移，并减少了由IL-6引发的多发性骨髓瘤细胞生长和存活[62]。依鲁替尼还抑制了多发性骨髓瘤样细胞在体外形成集落的潜力，可以想象这种药物也可能破坏多发性骨髓瘤细胞中的BTK信号传导。多发性骨髓瘤细胞中的BTK抑制也可能阻断涉及疾病进展的其他途径，因为多发性骨髓瘤中的TLR信号传导可能增加疾病进展[63]。

4.5 自身免疫性疾病 类风湿性关节炎(RA)是一种使人衰弱的全身性自身免疫性疾病，其特征在于在受影响的关节中循环自身抗体、滑膜炎症、血管翳形成以及软骨和骨质破坏[64]。已经进行了几项研究以研究BTK抑制在动物模型中的自身免疫中的功效。

依鲁替尼在人B细胞中选择性地阻断BCR信号传导，但不影响T细胞受体(TCR)信号传导。Chang等[65]通过对依鲁替尼在体内疾病模型中的作用研究了其在关节炎中的作用机制。依鲁替尼治疗在CIA模型和CAIA模型中降低了在该模型中起重要作用的促炎细胞因子和趋化因子，包括滑膜和血清中IL-6、IL-1β、IL-17、TNF-α、KC和IFN-γ的水平；对关节滑膜炎、血管翳形成、软骨和骨破坏的有效抑制，并且观察到BCR介导的B淋巴细胞增殖和功能的显著抑制。RN486是BTK的选择性可逆抑制剂[66]，在体外处理限制了人和鼠B细胞中CD69的上调以及向浆细胞的分化。它还限制了PBMC-B细胞共培养系统中体外IL-6和IL-2的产生。这表明BTK抑制也可以影响B细胞的细胞因子产生，尽管所涉及的途径仍有待阐明。

除类风湿性关节炎外，还在系统性红斑狼疮(SLE)模型中研究了BTK抑制剂的功效。在患有狼疮的MRL.lpr/lpr小鼠中，用依鲁替尼治疗限制了蛋白尿和血尿素氮水平的升高，说明肾功能障碍或损伤得到了保护。在该模型中，自身抗体和免疫复合物的形成对于疾病是必需的，并且在依鲁替尼治疗后血清抗dsDNA抗体水平降低[9]。依鲁替尼在B6.Sle1/B6.Sle1.Sle3狼疮易感小鼠发病前给药，降低了其自身反应性IgG但不降低IgM的水平，小鼠脾脏大小和脾细胞数量显著降低。这是由于活化的B细胞、GC B细胞和血浆母细胞，间接限制了CD4+和CD8+T细胞的活化，且巨噬细胞，树突细胞和嗜中性粒细胞未受影响，这表明依鲁替尼单独在B细胞中的作用足以抑制T细胞。与未处理的对照相比，处理的小鼠表现出肾损伤明显减少[10]。RN486在NZB×NZW狼疮小鼠疾病发作后，与未给药治疗的对照相比，停止了蛋白尿的进展并且降低了肾脏中IgM、IgG和C3以及巨噬细胞浸润的沉积。RN486抑制了B细胞活化，并且dsDNA特异性IgG浆细胞的数量减少，导致抗dsDNA抗体的血清水平降低，而不影响总浆细胞数量[67]。

以上数据表明，通过靶向不同病理途径抑制BTK，可以抑制或预防不同自身免疫模型中的疾病症状。

5 结论与展望

在这篇综述中，我们概述了我们目前对BTK信号通路的研究进展，以及BTK缺陷疾病与BTK抑制剂能够有效治疗的相关疾病。

近年来在确定BTK抑制剂的作用机制方面取得了很大进展，BTK参与不同的病理机制，现在看来很可能在很多情况下BTK抑制对肿瘤进展的影响是由B细胞上的各种受体和对微环境刺激的反应产生的信号的复杂相互作用的结果。因此，对恶性肿瘤中基因组畸变背景下BTK信号传导的致癌作用的新见解对于优化BTK靶向治疗剂的使用是至关重要的。需要更多的研究来了解哪些患者从哪种特定化合物中获益最多。高通量组合筛查策略应有助于确定可以优先用于临床研究的依鲁替尼组合。预期这种组合方案通过阻止对BTK抑制的抗性的发展和避免终身用抑制剂治疗而产生持久的反应。

我们已经讨论了BTK在自身免疫病理学中的潜在意义。然而，目前尚不清楚BTK蛋白是否在各种外周血B细胞亚群中差异表达，或者在自身免疫的情况下其在B细胞中的表达或活性是否增加。来自自身免疫动物模型中BTK抑制的有希望的数据表明，BTK的药理学调节可以为治疗B细胞分化中的自身免疫BTK信号传导和RA和SLE等自身免疫疾病提供有效的新治疗策略。