云南省禽腺病毒检测与分子流行病学调查

向文彬，陈俊宏,2，严红亚，李珂，覃袖伟，赵蓉，李会,2，信爱国*

(1.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

包涵体肝炎性-心包积水综合征(Inclusion body hepatitis-hydropericardial syndrome，IBH-HPS)是由禽腺病毒(Fowladenovirus，FAdV)引起的一种严重危害禽类养殖的疾病，尤其是3～6周龄的肉鸡，其发病突然，死亡率高，一般为20%～70%，病理解剖可见典型的心包积液和肝脏肿大出血[1，2]。本病既可横向传播又可垂直传播，其传播的主要途径是通过粪口途径。被感染禽类的肝脏在显微镜下显示肝细胞中有明显坏死灶和嗜碱性核内包涵体[2]。根据当前病毒分类系统，禽腺病毒可分为3个亚群，即Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒根据限制性内切酶酶切分析可分为5个型，即FAdV-A～FAdV-E；根据血清交叉中和实验可分为12个血清型，即FAdV-1～FAdV-8a、FAdV-8b～FAdV-11。Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡大理石脾病毒和禽类脾肿大病毒。Ⅲ群禽腺病毒仅包含减蛋综合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)[2，3]。最常见的是Ⅰ群禽腺病毒中的FAdV-4型感染。在国内该病先后出现在辽宁、安徽、山东、浙江等地[4]，最近几年也在西南地区陆续出现[5]。目前，云南省禽腺病毒流行情况尚缺乏相关报道和调查，本次流行病学调查可为今后云南省禽腺病毒的相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DL2000 DNA Marker购自天根生化科技有限公司，rTaq酶购自上海捷瑞生物工程有限公司,琼脂糖购自上海斯信生物科技有限公司。电泳仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司，凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司。

1.2 病料来源

对来自云南省内疑似禽腺病毒感染的发病禽类进行剖检，采取心脏、肝脏、脾脏、心包积液等组织样品共50份，送至云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所实验室进行分子生物学检测及基因序列测定与分析。

1.3 临床剖检

将病死禽进行临床解剖后观察其病理变化。

1.4 PCR检测

根据GenBank中收录的FAdV全基因组序列，针对病毒的Hexon基因的保守序列设计合成了1对特异性引物用于病毒检测及分子流行病学研究。引物序列为上游F：5′-ATGTCAGCAGTAGGCGAT-3′，下游R：5′-GCCGTCGCTCTAAGGGTC-3′，预期扩增1218bp，引物由擎科生物公司合成。对临床采集样品进行PCR检测。检测反应体系为25μL：rTaq酶12.5μL，ddH2O10.5μL，DNA模板1μL，上游引物、下游引物各0.5μL；PCR反应条件为94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，60s，35个循环；72℃，7min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 Hexon基因的同源性比较和聚类分析

将阳性PCR扩增产物纯化后进行Hexon基因序列测定，并用Vector NTI 8 软件拼接，从GenBank下载有关禽腺病毒的相关序列作为参考毒株(见表1)，采用MEGA 6.0软件，进行同源性比较和聚类分析。

表1 参考毒株信息

2 结果

2.1 临床剖检结果

临床解剖可见病死鸡心包积液，心包囊中积聚无色或琥珀绿色，水状或果冻状液体，心包整个呈现透明水荔枝状的形态，其内大约有10～30mL液体，心脏出现畸形和凹陷，心尖在心包囊中浮起，心包脂肪显示出淡黄色变色和瘀血；肝脏极度肿大，质脆易碎，有大面积的局灶性坏死斑块和上皮出血；脾脏肿大；肺脏瘀血、水肿；肠道出血；鸡胃角质层糜烂。

2.2 PCR结果

经PCR检测的所有样品中有3个可扩增出Hexon片段(1211bp)，禽腺病毒核酸检测阳性，见图1、图2。

M.DNA标准DL2000；1.阳性对照；2.阴性对照；3.FAdV-D11 YN20191128DUCK；4～7.样品。

M.DNA标准DL2000；1.阳性对照；2.阴性对照；3.FAdV-C4 YN20200320；4.FAdV-E8YN20191031；5～7.样品。

2.3 Hexon基因序列测定与结果分析

通过Vector NTI 8软件进行序列拼接，然后使用MEGA 6.0软件构建进化树比对测序结果。结果显示，检测的样品中编号YN20191128 FAdV-D样品与D11血清型参考毒株序列同源性为100%，编号YN20200320 FAdV-C样品与C4血清型参考毒株序列同源性为99.67%，编号YN20191031 FAdV-E样品与血清型为E8b参考毒株序列同源性为99%。说明目前的检测范围中云南省流行的禽腺病毒毒株主要为C4型、D11型、E8b型(结果见图3)；暂未发现其他血清型毒株。

3 讨论

禽腺病毒最早于20世纪70年代中期在我国台湾省出现，其主要流行型以血清Ⅰ型为主，临床症状不典型，病理学变化多为心包积液和包涵体肝炎。随着病毒的传播与突变，禽腺病毒感染已经成为当前养禽业疾病防控中不可忽视的一个重要问题。本次对云南省禽腺病毒流行病学调查发现云南省养禽业存在禽腺病毒，并呈流行趋势，主要流行毒株基因型集中为FAdV-C4型、FAdV-D11型、FAdV-E8型，其中FAdV-D11型主要存在于鸭类，其他流行毒株存在于土杂鸡和商品代蛋鸡。将继续对云南省内的禽腺病毒流行情况进行跟踪调查。

临床剖检方面，若病死禽出现典型心包积液与肝炎症状可怀疑为Ⅰ型禽腺病毒感染；若蛋禽出现明显产蛋下降并排除细菌类感染、新城疫等疾病时可怀疑Ⅲ型禽腺病毒感染，但若要确诊仍然需要进行分子生物学检测。

通过对PCR阳性产物的Hexon基因序列对比分析后发现，云南省流行的禽腺病毒主要是FAdV-C4型，通过对比GenBank数据库内参考毒株，与我国山东以及加拿大分离株的同源性高达99.67%。当然禽腺病毒的隐性感染率很高，这对普通的分子生物学检测方法也造成了不可避免的误差[6]。

禽腺病毒在云南省内的流行已经不局限于偶发性发病，这提示在实际生产中应该从阻断传染源、切断传播途径方向入手，在引进种禽时必须建立严格的隔离净化制度[7]，将新引入的种禽分群在距离原先禽舍较远的地方进行隔离观察饲养，有条件的应该进行全面血清学检测，如检测中遇到阳性群体应将其单独隔离进行饲养管理，并安全销毁病死禽。对未患病禽进行免疫预防，平时应该严格执行卫生消毒工作，对圈舍、饲料和饮水进行彻底的消毒，因为如其他疾病伴发时容易引起相关的免疫抑制病，从而引起交叉感染加剧病情恶化程度[8]。

目前，市面上也有很多关于禽腺病毒的疫苗，如油乳剂细胞灭活苗、全病毒灭活疫苗、弱毒灭活苗和亚单位疫苗[9]。选择与流行毒株基因型相匹配的油乳剂细胞灭活苗，对该病也能较好保护，且这种保护作用能传递给免疫禽的子代，对免疫禽及其子代的保护率分别达到100%和90%[10]。除此以外，还需要对原种场、祖代场等进行禽腺病毒的净化，才能有效地切断传播途径，减少该病毒的感染。

图3 禽腺病毒核酸序列的进化树