黑木耳凝集素LAA对巨噬细胞RAW264.7胞内NF-κB通路的影响研究

黄 东 马成瑶 张彦龙 *

（1黑龙江大学农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨150500；2黑龙江大学生命科学学院黑龙江省普通高校微生物重点实验室，黑龙江哈尔滨150080）

黑木耳不仅营养丰富，还具有众多的生物活性[1-2]。黑龙江省独特的地理位置和适宜的气候环境为黑木耳营养成分的积累提供了得天独厚的条件，为黑木耳的开发和推广奠定基础[3]。黑木耳中活性成分凝集素是一类非免疫起源的异源蛋白质，可以与细胞表面、细胞质或细胞核结构、细胞外基质中的糖蛋白相互作用，但不改变任何公认的共价结构[4]。凝集素在分化、细胞-细胞与宿主-病原体相互作用、细胞信号、血清糖蛋白周转、组织转移、先天免疫反应等多种生物学和病理学过程中发挥重要作用[5-6]。

NO 的释放是巨噬细胞的非特异性免疫的一种重要的机体防御过程的重要环节，当受到如肿瘤细胞、病原体及微生物等刺激时，巨噬细胞被活化并产生一系列的效应分子，NO便是其中之一[7]。一方面，NO 被作为巨噬细胞发挥杀伤靶细胞的重要信使分子，通过细胞间信息交换载体功能发挥免疫调节作用[8]；另一方面，NO对巨噬细胞吞噬的各类肿瘤细胞与微生物等具有细胞毒性。iNOS是诱导型一氧化氮合酶，催化L-精氨酸生成NO[9-10]，是哺乳动物体NO合成的唯一途径。NF-κB 是iNOS 基因转录与表达的调控因子，NF-κB 由 p65 和 p50 二聚体组成，如果与IκB 结合存在于细胞质中则是无活性的[11]。当受到调控时可导致NF-κB解离和易位至细胞核以及诱导促炎症因子基因的表达，如IL-1β、IL-6、TNF-α 和iNOS，从而促进NO的释放，调节细胞免疫[12-13]。

Typhoniumgiganteum 凝集素（TGL）可以通过ROS 和NF-κB 细胞信号通路诱导炎性因子（TNF-α、IL-1β）的产生且呈现时间剂量依赖性[14]。半夏凝集素（PTL）可以通过ROS和NF-κB细胞信号通路诱导炎性因子产生[15]。黄精凝集素（PCL）可以激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）成员ERK、JNK 和p38，以及NF-κB 信号通路，因此PCL 可以作为一种潜在的靶向凋亡和自噬通路的抗肿瘤药物[16]。凡纳滨虾C 型凝集素（LvCTL4）可以通过NF-κB 信号通路参与抗菌免疫应答[17]。家蝇凝集素（MPL）通过NF-κB信号通路参与抗病毒[18]。笔者通过研究黑木耳中凝集素是否以不依赖LPS 的形式通过NF-κB通路促进RAW264.7细胞调节炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌以及NO 的分泌，为实现黑木耳的药用价值提供参考，并为后续黑木耳其他成分的活性研究提供坚实的理论基础，同时也为东北黑木耳的深加工提供方向和依据，为产业化生产东北黑木耳提供更广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

RAW264.7 细胞，委托哈尔滨海基生物公司购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；黑木耳凝集素LAA，黑龙江大学生物制药实验室前期纯化得到；RPMI 1640 培养基，美国Hyclone；胎牛血清，美国Gibco；iNOS 抗体、NF-κB p50 抗体、NF-κB p65 抗体，上海生工生物工程股份有限公司；全蛋白抽提试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；PDTC 抑制剂，上海碧云天生物技术有限公司；PBS 缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 主要仪器

DYY-7C 型电泳仪，北京市六一仪器厂；Chemi⁃Doc XRS 凝胶成像仪，美国 Bio-Rad；ELITE 蛋白印迹仪，威泰克有限公司；Biofuge 22R 高速冷冻离心机，美国 Beckman 公司；Milli-Q 纯水器，美国 Milli⁃pore 公司；BCM-1000 型生物净化工作台，苏州江东精密仪器有限公司；MLS-3750 高压蒸气灭菌器灭菌锅，德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳凝集素的提取

（1）采摘后的新鲜黑木耳用蒸馏水洗净，分装成小袋，分别放置在-20 ℃保存，避免黑木耳反复冻融，破坏蛋白质[19]。

（2）选取优质新鲜黑木耳用蒸馏水洗净，冻干并用粉碎机粉碎。称取适量冻干黑木耳粉，用PBS将其浸泡过夜。第二天将浸泡液3 000 r/min 离心30 min，上清液4 ℃保存。向黑木耳上清液缓慢加入20%～80%不同饱和度硫酸铵，4 ℃沉淀过夜，8 000 r/min 离心25 min，收集沉淀。将收集回来的沉淀用少量PBS缓冲液溶解后，4 ℃透析2 d，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素粗品。

（3）用PBS溶解黑木耳凝集素粗品并过滤后，与等体积的猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖4B（PSM-Sepharose）充分混合，4 ℃ 搅拌过夜[20]。次日，装到层析柱内，用PBS 以1 mL/min 的流速洗掉杂蛋白，当基线稳定后，再用pH 3.0 甘氨酸溶液以1 mL/min 的速度洗脱，并收集洗脱液。将洗脱液透析除盐后冷冻冻干，即得到黑木耳凝集素，并命名为LAA，采用SDS-PAGE检测LAA的纯度。

1.3.2 ELISA法检测抗炎因子量

PDTC 是NF-κB 常用抑制剂。试验采用不同浓度的PDTC 处理RAW264.7细胞，用PBS 缓冲液清洗PDTC后，再用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA处理。共设5个处理，处理1（对照）：未添加PDTC和LAA，处理2：仅添加10 μg/mL的LAA，处理3：添加5 μmol/LPDTC+LAA，处理4：添加 10 μmol/L PDTC+LAA，处理 5：添加 20 μmol/L PDTC+LAA。用 ELISA 试剂盒检测黑木耳凝集素对RAW264.7 细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的影响。根据试剂盒说明书操作。

1.3.3 Griess法检测NO分泌量

试验设计与处理同1.3.2。用Griess法检测黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌NO的影响[21]。

1.3.4 Western blot分析

（1）RAW264.7 细胞铺满80%平底面积时，消化细胞，将细胞稀释至 1×106个/mL，接种于100 mm 培养皿内，37 ℃、5%CO2培养过夜。用不同处理方式处理巨噬细胞后，收集细胞并放置在-80 ℃保存[22]。

（2）

1.4 数据统计分析

所有试验均重复三次，试验数据均以平均值±标准差（means±SD）表示，用SPSS 17.0 版统计分析，P<0.01表示差异极显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黑木耳凝集素LAA提取纯化

2.1.1 不同浓度（NH4）2SO4沉淀组分结果

图1 不同浓度（NH4）2SO4沉淀组分的质量

由图1可知，浓度为40%（NH4）2SO4的沉淀组分冻干粉质量最多，其次是浓度为50%（NH4）2SO4的沉淀组分，当用浓度为80%的（NH4）2SO4沉淀时，冻干粉质量小幅度提高，推测是由于部分蛋白溶解度较高造成，但与40%浓度差异显著，所以选择浓度为40%（NH4）2SO4沉淀组分进行亲和层析，进一步纯化黑木耳凝集素。

图2 黑木耳凝集素亲和层析

黑木耳凝集素粗品用PBS 溶解后，经离心过滤后，与PSM-Sepharose 结合。装柱洗脱，结果如图2所示。先用pH 7.4 PBS 洗脱未与PSM-Sepharose 结合上的杂蛋白，随着洗脱体积的上升，杂蛋白逐渐被洗脱掉；当洗脱到24～33 mL 时，吸光值不再发生变化，说明杂蛋白已经完全被洗脱了。之后改用pH 3.0 Gly 洗脱，出现单一洗脱峰，说明，经过亲和层析得到了黑木耳凝集素，将34～45 mL洗脱液用酸中和、合并，透析冻干，冻干粉为黑木耳凝集素，命名为LAA。

2.1.2 黑木耳凝集素的纯度检测

由图3 可看出样品所在泳道为清晰的单一条带，说明试验所用方法分离到的黑木耳凝集素可能为单亚基蛋白，分子量初步推测约为20 kDa。食用菌中检测到的凝集素多数为单亚基蛋白，分子量范围较大，一般在10～100 kDa。通过纯度鉴定可确定黑木耳凝集素LAA 已经得到了纯化。

图3 SDS-PAGE电泳纯度鉴定结果

2.2 LAA对抗炎因子的影响

结果如图4 所示，处理 2 的 IL-1β 分泌量最多，为61.26 pg/mL；处理 3、处理 4、处理 5 的 IL-1β 分泌量分别为：55.23 pg/mL、48.33 pg/mL、38.28 pg/mL。处理2～5 的IL-1β 分泌量与对照相比均呈现极显著性差异[图4（A）]，虽然 IL-1β 分泌量随着抑制剂PDTC 的浓度增大而有所降低，但仍然极显著高于对照。

处理 2 的 IL-6 分泌量最高，为 572.32 pg/mL；处理 3、处理 4、处理 5 的 IL-6 分泌量分别为：527.28 pg/mL、442.58 pg/mL、313.49 pg/mL。处理2～5 的IL-6 分泌量随着抑制剂PDTC 的浓度增大而有所降低，但仍然与对照存在极显著差异[图4（B）]。

处理2 的 TNF-α 分泌量最高，为 502.53 pg/mL；处理 3、处理 4、处理 5 的 TNF-α 分泌量分别为：488.30 pg/mL、453.18 pg/mL、428.72 pg/mL。处理2～5 的TNF-α 分泌量与对照呈现极显著性差异[图4（C）]。

图4 表明，PDTC 可通过抑制 NF-κB 通路中三种炎症因子的分泌而抑制该通路，随着浓度增加抑制作用更强。但加入LAA 的处理组与对照组相比，三种炎症因子的分泌量均显著增加，虽然随着抑制剂浓度增加分泌量有所下降，但足以说明LAA 可以通过NF-κB 信号通路促进炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的产生。

图4 PDTC对黑木耳凝集素LAA诱导RAW264.7细胞产生炎症因子的影响

2.3 LAA对巨噬细胞RAW264.7分泌NO的影响

图5 PDTC对凝集素LAA诱导RAW264.7细胞产生NO的影响

结果如图5，处理2 的NO 分泌量最高，为76.25 μmol/L；处理3、处理4、处理5的NO分泌量分别为67.92 μmol/L、55.42 μmol/L、47.08 μmol/L。处理2～5与处理1对照组相比，呈现极显著性差异。虽然添加PDTC 可以抑制NO 分泌量，但是经过LAA 处理后，NO的分泌量仍然高于对照的分泌量，表明黑木耳凝集素LAA可以通过NF-κB信号通路诱导NO的分泌。

2.4 LAA 对巨噬细胞RAW264.7胞内NF-κB通路关键蛋白的影响

考察黑木耳凝集素LAA 对RAW264.7细胞处理不同时间后，用Western blot 分析对细胞NF-κB p50和NF-κB p65 蛋白表达量的影响。结果如图6 A 所示，与对照相比，黑木耳凝集素LAA 可以促进NF-κB 蛋白的表达。通过对条带灰度分析，结果如图6中的B、C 所示，黑木耳凝集素LAA 处理RAW264.7细胞20 min 时NF-κB p50 蛋白表达量最多（图6B）；黑木耳凝集素LAA 处理RAW264.7 细胞60 min 时NF-κB p65 蛋白表达量最多（图6C）。结果表明：黑木耳凝集素LAA可以激活NF-κB通路。

图6 黑木耳凝集素LAA作用对RAW264.7细胞产生NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表达结果

3 小结与讨论

研究表明，不添加任何浓度的PDTC 抑制剂，用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA处理RAW264.7细胞后IL-1β 分 泌 量 为 61.26 pg/mL，IL-6 分 泌 量 为572.32 pg/mL，TNF-α 分泌量为502.53 pg/mL。在加入不同浓度PDTC 抑制剂后，再用10 μg/mL 黑木耳凝集素LAA 处理后，仍能分泌出不同量的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α，因此，LAA 可以促进炎症因子的产生。

不添加任何浓度的PDTC 抑制剂，但用10 μg/mL黑木耳凝集素LAA处理RAW264.7细胞后NO 分泌量为76.25 μmol/L，且添加不同浓度抑制剂后也仍然可以分泌NO，说明黑木耳凝集素LAA 可以调节NO的分泌，具有免疫调节活性。

根据试验结果可以推断，黑木耳凝集素是通过NF-κB通路来调节免疫细胞的作用发挥。从细胞通路上证明了黑木耳凝集素可诱导炎症因子及免疫细胞活性的增强。目前黑木耳中研究较多的成分为黑木耳多糖及蛋白质[23]，但这两种成分在现有的研究中，均未有可以调节此免疫通路的报道，这一发现可为黑木耳的新药用价值开发提供理论依据。