利用真空冷冻干燥法制作大型真菌标本

陈俊良 练长勋 叶晓星 吴国锋 陶祥生

利用真空冷冻干燥法制作大型真菌标本

陈俊良 练长勋 叶晓星 吴国锋 陶祥生*

（庆元县食用菌科研中心，浙江 庆元 323800）

介绍利用真空冷冻干燥技术制作大型真菌标本具有较多优点：可保持标本外观大小、形状、颜色不变，蛋白质等物质不变性；制成后的标本，科研价值高，可进行孢子显微观察、形态学和分子生物学鉴定，有效成分测定等科学研究，保存在放有硅胶干燥剂的密封袋中，拿取方便；该法操作方便，适用于保存各种大小、颜色的大型真菌标本。具体操作步骤为采集新鲜完整的大型真菌子实体标本，除杂；使用－40°C冰箱预冻处理；利用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥；将冻干标本放置在密闭的亚克力标本瓶、密封袋中保藏。

大型真菌标本；真空冷冻干燥；亚克力标本瓶；科研价值

大型真菌含水量高，容易腐烂、生虫，在标本处理、保藏上具有一定难度。传统大型真菌标本的制作方法主要采用浸渍法和干制法[1]。浸渍标本一般保存在甲醛、乙醇、冰醋酸等易挥发保存液中，标本易发硬变脆、褪色，不保鲜，保存液易浑浊，必须经常更换[2]。干制标本是采用日晒、烘干或风干的方法进行干燥处理，标本易失水而严重变形，且易虫蛀、回潮、霉变等[2]。

近年来，也新研发了一些大型真菌标本的制作方法，专利《一种大型真菌标本的制作方法》（CN107668028A）公开了一种向模具中灌注环氧树脂型水晶滴胶包裹大型真菌子实体的标本制作方法。专利《一种大型真菌标本的制作方法》（CN105325404A）公开了一种将真空干燥后的标本完全浸渍于环氧树脂中，直至完全渗透，取出标本沥干保藏的大型真菌标本制作方法。专利《一种大型真菌标本的制作方法》（CN104996397A）公开了一种将大型真菌标本用聚乙二醇塑化，塑化后的标本用滤纸吸干其表面塑化剂，再用透明脲醛树脂与塑化好的大型真菌标本完全融合的方法。但这些方法使得大型真菌标本包埋于环氧树脂、透明脲醛树脂等中，无法取出进行显微特征观察、形态学鉴定和分子生物学鉴定，在种名确定上具有很大难度。此类标本仅适用于科普展示，不适用于科学研究。

真空冷冻干燥法是将含水物质冻结成固态，然后在低温、真空状态下使其中的水从固态升华成气态，最终除去水分而保存物质的方法。笔者于2013年开始尝试利用真空冷冻干燥技术制作大型真菌标本，干燥后存放在有硅胶干燥剂的密闭亚克力标本瓶和密封袋中。此方法具有以下优点：一是保持标本外观大小、形状、颜色不变；大型真菌的蛋白质等物质也不会变性。二是科研价值高，冻干后的标本可保存在硅胶干燥剂的密封袋中，方便拿取，可进行孢子显微观察、形态学和分子生物学鉴定、有效成分测定等科学研究。三是操作方便，适用于保存各种大小、各种颜色的大型真菌标本。四是采用透明度高的亚克力标本保存，便于清晰地、全方位地观察标本。

本方法突破了传统烘干标本，因缩水变形严重、褪色而形态学鉴定困难等问题，也解决了新型包埋展示标本，难以取出鉴定研究等难题，是一种既能适用于科普展示、教学，又适用于科学研究的大型真菌标本制作方法，为大型真菌标本制作开辟了新的路径。目前，已经制作真空冷冻干燥标本200余份，其中130种陈列展示于浙江省丽水市博物馆。

1 设备与材料

LGJ-50C冷冻干燥机，亚克力标本瓶，密封袋，变色硅胶。

2 标本制作步骤

标本制作流程：大型真菌标本采集→记录建档→标本表面清理→预冻处理→设定冻干工艺程序→真空冷冻干燥→装瓶密封。

2.1 标本预处理

采集新鲜、完整的大型真菌子实体标本，进行初步整理，除去泥土和杂物，记录形态学特征，填写档案卡；将标本按照大小、厚薄进行分类，置于－40 ℃冰箱预冻处理6～8小时。

2.2 冷冻干燥

将冷冻干燥机提前1小时启动，至冷阱温度达到－40 ℃时，将已预冻的标本从冰箱移到冷阱托盘内。设定冷冻干燥机冻干工艺程序，真空干燥16～20小时。

2.3 标本保存

真空干燥结束后，将标本从冻干机取出迅速放到干燥器皿中，避免回潮；在亚克力标本瓶底部粘贴泡沫底座，将标本固定在底座上，周边放置变色硅胶，迅速密封。同时，留存一份冻干标本放入装有标色硅胶的密封袋中，用于形态学和分子生物学鉴定。

3 真空冷冻干燥

3.1 冷阱准备

将冷冻干燥机提前1小时启动，至冷阱温度达到－40 ℃，将已预冻的标本冰箱移到冷阱托盘内，密封冻干机盖子。在实时监控界面，轻触至预冻按钮，将冷量切换至冷阱，待冷阱温度到－55℃以下维持15分钟以上，冷阱准备结束。

3.2 真空干燥工艺程序

在实时监控界面，点击真空泵关按钮，启动真空泵。待真空泵降到30帕以下后，点击控温按钮，启动冻干工艺程序控制，升华干燥按预先设定的工艺程序运行。具体冻干工艺程序如下。

①搁板温度从－40 ℃升至－30 ℃，在－30 ℃保温1.5 h；②搁板温度从－30 ℃升至－20 ℃，在－20 ℃保温1.5 h；③搁板温度从－20 ℃升至－10 ℃，在－10 ℃保温2.5 h；④搁板温度从－10 ℃升至0 ℃，在0 ℃保温2.5 h；⑤搁板温度从0 ℃升至5 ℃，在5 ℃保温2.5 h；⑥搁板温度从5 ℃升至10 ℃，在10 ℃保温2 h；⑦搁板温度从10 ℃升至15 ℃，在15 ℃保温1 h；⑧搁板温度从15 ℃升至20 ℃，在20 ℃保温1.5 h；⑨搁板温度从20 ℃升至30 ℃，在30 ℃保温2.5 h。

最后，打开放水进气阀，使空气缓慢进入冷阱腔（真空度显示数字回升），按真空泵开按钮，使真空泵停止运转。关闭压缩机，取出冻干标本。

[1] 李朋员, 孙淑玲, 谭屏, 等. 一种大型真菌展示标本的制作方法[J]. 生物学通报, 2012, 47(05): 49.

[2] 吴小杰, 李峻志, 祁鹏, 等. 一种大型真菌标本制作方法[P]. 发明专利（CN104996397A）.

浙江省食用菌种质资源库建设项目（CTZB-F190830LWZ-SZZZ2）

陈俊良（1985—），男，农艺师，主要从事野生菌资源调查与利用的研究。E-mail：chenjunliang1026@126.com。

陶祥生（1963—），男，农艺师，主要从事食用菌栽培技术研究。

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2095-0934（2020）03-211-02