2种复壮方法对球孢白僵菌菌种复壮的影响分析

贾丽萍，王宏勋，陆俊宇，杨云波，高 源，王 兴

(1.玉溪市林业和草原局，云南 玉溪 653100；2.玉溪市红塔山自然保护区管护局，云南 玉溪 653100)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一种广谱性昆虫病原真菌，玉溪市红塔山自然保护区管护局于1979年开始采用固体培养生产工艺生产球孢白僵菌。菌种的保藏及复壮是日常生产中一个非常重要的环节，而菌种在保藏或使用过程中，经过多代培养后会产生退化现象，表现为菌丝生长慢，呈稀疏的长毛状，菌苔薄，用接种针挑取孢子时往往挑到一层白色的薄皮，孢子产生时间推迟，产孢量减少，有时在菌苔表面出现一些小包状的突起——菌丝束或菌丝孢丛，在其上产生不育孢子，导致毒力降低。一般菌种经过转接7～8代后必须进行菌种复壮，使其恢复或提高原有的特性。本文采用最常用的活虫复壮法、虫尸复壮法对球孢白僵菌菌种进行复壮试验分析，研究在生产实践中，究竟采用哪一种复壮法简单易行，且能降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试菌种

试验所用菌种为自产球孢白僵菌一级菌种，菌种保藏时间5年，保藏方法为水浸保藏法，保藏温度为4℃。

1.1.2仪器

手提式压力蒸汽灭菌器，规格型号YXQG04B，由淄博高新技术产业开发区新华医疗科技园制造；医用型超净工作台，规格型号SW-J,由中日合资苏州安泰空气技术有限公司制造。

1.1.3其他材料

试验材料包括镊子、酒精灯、医用搪瓷托物盘、蒸馏水、棉球塞、白橡胶塞、养虫箱、枝剪、剪刀、培养皿、试管、橡皮手套、接种针、试管、电磁炉。

1.1.4供试虫源

2019年4月19日采自云南省玉溪市江川区九溪镇鸡窝土官田后山地4～6龄思茅松毛虫幼虫。其中，采集的活虫放在干净的养虫箱内饲养，活虫采集时要注意避免人为造成幼虫死伤，尽量做到当天采集当天处理。

1.2 复壮方法

1.2.1活虫复壮法

将林间采集到的鲜活思茅松毛虫4龄幼虫20只分别放入2个养虫箱内，每箱装10只。从冰箱中取出待复壮的球孢白僵菌菌种，用事先消好毒的接种针或镊子将孢子粉轻轻刮下，按需称量倒入装有蒸馏水的三角瓶中，加入适量洗衣粉充分摇匀，最终稀释成含孢子量2亿个/mL的菌液，将稀释好的菌液喷洒在养虫箱内的活虫和针叶上，喷洒的剂量以箱内针叶潮湿但不滴水为宜，为提高养虫箱内的空气湿度，每个箱中放一杯清水。在另一养虫箱内设同等数量的活虫喷清水进行饲养对照。平常管理注意及时更换新鲜的油杉枝条或云南松松枝，并观察感病情况，记录思茅松毛虫死亡时间和数量。将感病死亡的思茅松毛虫用蒸馏水洗下其菌丝孢子，同样的方法再喷到鲜活的虫体上。如此重复2次，选取最后一次感病虫体进行分离纯化保存。

1)菌种的分离提纯

采用活虫复壮法进行菌种复壮时，活虫在感病的过程中往往会感染大量其它杂菌，因此需要对复壮过的虫体进行分离，以得到纯化的球孢白僵菌菌种。

2)分离方法

采用组织分离法进行分离。于无菌接种箱中或超净工作台上将用活虫复壮的感病僵虫(未长出孢子粉)在酒精灯火焰下进行表皮消毒，杀死表皮杂菌，然后将虫尸剪成0.5 cm大小的方块，放置到事先准备的盛有0.1%L汞水的培养皿中浸泡消毒5 min，然后在装有无菌水的培养皿中清洗，取出放置于消毒滤纸上待用，将滤去水分的组织块接种于事先准备好的斜面试管中进行培养，组织块长出菌落后挑取未受感染的进行转接，反复2～3次可得到纯化的菌种。

1.2.2虫尸复壮法

将采集到的5～6龄思茅松毛虫幼虫20只用开水烫死，用滤纸吸掉虫体上的水分，在酒精灯火焰上去掉过长的体毛，以便接种后孢子容易接触到虫体。用酒精擦一遍虫体进行体表消毒，将处理好的虫尸装入试管里，每管装一只幼虫尸体，塞上试管塞，放平待用。用牛皮纸或耐高温的塑料纸包好平放于高压灭菌锅内，保持锅内压力0.14 MPa、温度126℃、灭菌30 min，灭菌结束后，取出置于超净工作台上进行冷却并用紫外灯照射30 min进行处理。当虫体温度达到28～30℃时，挑取待复壮的菌种孢子进行接种培养。培养15～20 d后，待虫体上的孢子成熟后，再挑取虫体上的孢子接种到新的虫尸上，如此反复3次。最后一次复壮的虫尸放冰箱中保藏待用，生产中需要时取出进行扩转。

1.2.3接种培养

1)斜面培养基制作

称取马铃薯200 g(去皮洗净)，葡萄糖20‰，蛋白胨10‰，琼脂17‰，MgSO41‰,KH2PO40.5‰,水 1 000 mL。将马铃薯切成片，加水 1 000 mL煮沸20 min,然后用双层纱布过滤，取马铃薯汁，不足 1 000 mL加水补足，然后依次加入葡萄糖、蛋白胨、琼脂、MgSO4、KH2PO4,加热至全部溶解，用漏斗分装到试管中待用。培养基的分装剂量以占试管总高度的 1/4～1/3 为宜。

2)固体培养基制作

按所需量称取小麦三级面粉 1 000 g、高锰酸钾0.1 g、水250 mL,将高锰酸钾倒入水中溶解搅拌均匀，然后慢慢加入装有面粉的盆中混拌揉匀，揉成有韧性的面团，用擀面棒擀成薄片，切成10 cm×0.5 cm×0.5 cm左右的长条装入试管，塞上棉塞；同时也用此方法将薄片按培养皿大小制成培养皿固体培养基。

将准备好的思茅松毛虫虫尸、斜面培养基和制备好的固体培养基、面块做成的培养皿放入高压锅内消毒。保持锅内压力0.14 MPa、温度126℃、灭菌30 min，灭菌结束后，取出置于超净工作台上进行冷却并用紫外灯照射30 min进行处理。

3)接种

斜面管接种方法：对灭菌好的斜面培养基须在无菌条件下(即在接种箱内)进行接种，接种前须用酒精对双手及接种工具进行消毒，然后于酒精灯火焰下再次对接种针进行火烧灭菌，接种针冷却后才能挑取菌种孢子粉进行转接，如果试管壁上有冷凝水，先用无菌棉球将其擦干，然后挑取孢子粉在培养基上从底部至顶部划线，力度要确保培养基不被划破。

固体培养基试管的接种方法：先将灭菌好的固体培养基放在超净工作台箱内进行接种，取一支准备好的转接种试管，于酒精灯火焰下用酒精对整支试管进行擦拭消毒，左手握管，用右手小手指和无名指夹住试管棉塞，用酒精棉球对管口内壁进行消毒，同时取一支待接种的试管用左手食指和中指夹住，无名指和小指夹住转接种试管，大拇指同时握住试管，接种针在酒精灯火焰下烧红消毒，迅速放入装有面条培养基的试管中冷却，然后轻轻放进转接种试管内，挑取孢子粉放进待接种试管培养基上，从试管最底部拉至培养基顶部，并对面条培养基进行搅动，使孢子粉能在整个培养基上分布均匀，最后塞上棉塞，再取另一支试管进行接种。

4)接种后培养

将接种后的斜面试管、固体培养基试管平行摆放于培养室内进行培养，培养室采用空调将室温控制在25℃，在培养期间注意观察污染情况，如果发现有污染情况，及时移出，培养15～20 d即可得到成熟的斜面菌种和固体培养基菌种。

1.2.4复壮菌种的长势对比

1)采用虫尸复壮的球孢白僵菌菌种接入不同培养基

在无菌的超净工作台中用虫尸复壮的球孢白僵菌菌种接入已消毒灭菌的45支试管固体培养基，再接入30支思茅松毛虫虫尸做成的培养基，接完后统一放入自然室温(25℃)培养室内培养观察记录(接种时间为2019年5月15日15时)。

2)采用活虫复壮的球孢白僵菌菌种接入不同培养基

在无菌的超净工作台中用活虫复壮的球孢白僵菌菌种接入已消毒灭菌的45支试管固体培养基，再接入30支思茅松毛虫虫尸做成的培养基，接完后统一放入自然室温(25℃)培养室内培养观察记录；在培养期间注意观察杂菌污染情况，发现污染及时移出，并做好观察记录(接种时间为2019年5月15日16时)。

2 结果与分析

2.1 活虫复壮法结果

喷洒菌液3 d，供试幼虫行动迟缓，有明显感病症状，到第5天，可见孢子在虫体上点状萌发，第10天后可见粉状孢子，这些带杂菌的孢子再进行第二次活虫喷洒的时候，杂菌的数量也在增长，反复3次得到的白僵菌孢子需要进行转管提纯。因此该方法复壮所需时间周期长，工作量大。

2.2 虫尸复壮法结果

在虫尸上接种，第2天就萌发，长势快，第4天已全部长满虫尸培养基。用虫尸作培养基，由于是天然培养基，具备丰富的碳源、氮源、矿质元素，再加上经过高温消毒，几乎无污染，反复2～3次就能得到复壮菌种。该方法复壮周期短，工作量小。

2.3 同一种复壮方法接入不同培养基上长势及污染情况对比

2.3.1虫尸复壮的球孢白僵菌菌种

采用虫尸复壮的球孢白僵菌菌种接种在不同培养基上，其长势和污染程度存在差异。虫尸培养基是天然培养基，含有天然的有机物质，具备丰富的碳源、氮源、矿质元素，其优点是营养较丰富，且母种是虫尸，具有丰富的动物性氮源；固体试管培基由于氮源来源于小麦，氮源不及虫尸培养基丰富，所以长势较慢，2种培养基由于母种是虫尸复壮球孢白僵菌菌种，所以抗性较强，在培养过程中都无污染情况(表1)。

表1 采用虫尸复壮球孢白僵菌菌种接入不同培养基上观察记录

2.3.2活虫复壮的球孢白僵菌菌种

采用活虫复壮方法接种在不同培养基上，其长势和污染程度存在差异。虫尸培养基较固体试管培养基萌发长势快，虫尸培养基由于是天然培养基，其氮源比固体培养基的丰富，母种经提纯后获得，且无污染，但接种在2种培养基上，其固体试管培养基萌发慢，培养中1支受污染，可能在接种操作过程中受到杂菌的污染(表2)。

表2 采用活虫复壮的球孢白僵菌菌种接入不同培养基上观察记录

3 结论

在本试验中，待复壮菌种是采用浸菌种保藏法保藏5年的球孢白僵菌菌种，把孢子接种到林间采集4～6龄思茅松毛虫上，采用虫尸复壮法和活虫复壮法进行复壮，2种方法都可使衰退的菌种得到恢复。其中，虫尸复壮法最优，操作简单，污染小，转管容易；活虫复壮法在害虫自然感病的过程中容易感染其他杂菌，需要经过多次提纯才能使用。

球孢白僵菌作为一种活体真菌，其生长发育的条件包括营养物质条件和环境条件。碳、氮、磷被称为培养球孢白僵菌的3要素，因此选择好培养基，能供给微生物生长繁殖的基质。在本试验中2种复壮后的球孢白僵菌菌种接种在不同的培养基上对比，以虫尸为培养基进行接种，因其能提供较好的动物性氮源，以保证菌株的生产活力，所以长势较快，长势和污染程度均优于固体培养基。而固体培养基在制作过程中加入0.1 g 的高锰酸钾，能很好地抑制其他杂菌的污染，但可能在接种培养中也会推迟球孢白僵菌的孢子萌发时间，因此用虫尸培养基接种培养要优于固体培养基接种。