DNA 测序关键技术分析

秦子阳

（四川省成都市郫都区嘉祥外国语学校，四川 成都 610000）

1 基因的基本结构和功能特点

基因是在DNA 上具有遗传信息的片段，所以基因的结构和DNA 一样，基因也是由四种碱基（ATCG）所对应的脱氧核糖核苷酸组成的。这四种脱氧核糖核酸可以组成一条单链，再和另外一条互补链组成双链结构。DNA 最大的特点之一便是半保留复制，意思是在复制的时候，双链解开，其他的游离的脱氧核苷酸以其中一条母链为模板进行复制，半保留复制这个特点有着很重要的意义[1]。

2 DNA 测序技术

2.1 焦磷酸（一代）测序基本原理及测序仪。Sanger 法是1977 年由Sanger 发明的，也是在第 一代测序技术中被应用最多的技术。其测序的基本原理是，在DNA 合成的体系中加入双脱氧核糖核酸（ddNTP）。当双脱氧核糖核酸和DNA 链结合的时候，就不会形成磷酸二酯键，所以反应就终止了，因此形成了很多的DNA 模板[2]。每一个双脱氧核糖核酸上面有一定的放射性标记，而且每一个都不一样，然后通过凝胶电泳，检测放射性同位素的标记，然后我们就可以通过分析来确定各个位点上所对应的碱基。该测序技术代表性DNA 测序仪器为：毛细管测序仪。

2.2 第二代测序基本原理及测序仪。由于第一代测序技术的优化与发展是建立在 Sanger 法的原理之上，所以测序中的电泳过程始终 是限制第一代测序技术效率的瓶颈。第二代测序 技术又称下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术，是对第一代测序技术的划时代变革[3]。

第二代测序仪先通过物理或者化学的方法将DNA 打碎成小片段（分子量片段大小为200-500bp），然后在这些DNA 片段上面添加接头，形成了DNA 文库。然后在flowcell 中引物会和样品DNA 中的接头结合，将其固定在通道的表面，形成bridge[4-5]。然后通过桥式PCR 扩增，可以增强碱基的信号强度。在桥式PCR 扩增中，因为在3 端的羟基有特殊的保护，所以每次只能添加一个dNTP，然后其他的DNA 链就会被洗掉，只留下这一条链。然后再加入缓冲液来激发荧光，再通过光学仪器捕捉光学信号，然后把信号传输到计算机里，计算机就可以把光学信号转化为碱基的序列。该DNA 测序技术代表性测序仪为：①焦磷酸测序：454 测序仪、Ion Torrent/Proton 等；②新一代SBS：Illumina、BGISEQ-500、Max-Seq、LaserGen；③连接测序：solid。

2.3 第三代测序基本原理及测序仪。虽然第二代测序技术已经得到了广泛的应用，并在各技术方面趋于成熟，但是无法避免的是在必要的流程上，如PCR 扩增、荧光分析等方 面，带来的成本和效率限制以及不可避免的系统误差。第三代测序技术，又被成为“下、下一代测序”，基于单分子读取技术，不需要PCR 扩增，具有巨大的应用前景。

Pacbio：在DNA 合成的体系中，加入DNA 聚合酶，然后DNA 聚合酶就会捕获这些DNA 模板，将其束缚在零模波导孔中，再加入dNTP，随着不同的碱基进入，就会发出不同的荧光，通过分析光的波长和峰值就可以判断这个碱基的类型Nanopore：纳米孔技术主要是用了电信号来判断碱基类型。当DNA 碱基通过纳米孔的时候，他们会使电荷发生变化，从而短暂的影响通过纳米孔的电流强度，因为每一种碱基所造成的电流变化的幅度不同，所以通过电子设备来检测这个差异就可以从中分析通过的碱基是哪一种[6-7]。

3 DNA 测序关键技术方法

3.1 点测序（PCR 扩增原理和方法）。点测序是专门专注于某个片段的测序方法。而这种方法就需要用的PCR 扩增方法。PCR 扩增是通过模拟体内的环境，使DNA 片段在体外进行指数bei7 的扩增。当DNA 被提取出来以后，被放入热循环仪里进行扩增，同时需要的还有dNTP，DNA 聚合酶，引物，以及镁离子。

PCR 扩增主要有三个步骤：变性，退火，延伸。当DNA 被加热到大约93-95 度时，DNA 的双链会解开，形成两条DNA 模板。在下一个步骤退火的时候，温度大约会降至比变性温度低25 度的温度，这个时候引物会以DNA 母链为模板进行互补配对结合。在延伸的阶段时，dNTP 会在DNA 聚合酶的作用下合成新的互补链，通过多次重复以上的操作，DNA 会在体外呈指数倍扩增。

3.2 靶区域测序。靶区域测序是对一个较大的区域或者几个不同的基因组区域进行测序的方法，也是属于DNA 捕获（DNA capture）的方法。这种技术就是把基因组的DNA随机打断成小片段，然后再片段的两头加上特异性接头，然后芯片上的特异性结构和接头连接后，就会连在一起，然后对他们进行洗脱，把最后得到的再拼接起来，这就是靶区域测序。

3.3 全基因组测序。全基因组测序是将DNA 模板随机打断，然后将所有片段的序列整体组装成为一个整个的基因组的序列。

3.4 Indexing 测序。Index 是像一个标签，他对每一个测试的个体，每一个序列上面都要加上一个标签，每次测完之后，这种标签可以把每一个样本相互区分开，再通过其他方法去掉标签。

4 展望

随着科技水平的持续进步，DNA 测序技术的发展呈现出加速趋势，不断地从物理学、光学、电学等领域借鉴最新的发明技术来满足生物领域对测序技术日益提高的要求[8-9]。当然，DNA 测序技术也在逐步扩展其应用领域，在目的DNA片段被鉴定出来后及时地进行测序，有助于进一步深入研究的开展。

各类的测序仪产生的大量数据也给研究人员带来困难。一方面，测序仪产生的数据量很大，研究人员需要掌握生物信息学的相关技术，并且懂得如何对数据进行分类储存整理，才能有可能挖掘出原始测序结果背后潜在的意义。而通常对测序结果进行分析的工作是由负责测序的生物公司进行的。另一方面，测序仪生产商只提供了特定的测序结果处理软件，并未有其他下游的生物学信息分析软件可以选择[10-11]。如何建立标准化的测序信息分析软件是亟需待解决的问题。相信随着DNA 测序技术的不断完善，各类的测序仪之间也会建立统一的测序标准。