H146-like 鹅嵌杯病毒TaqMan-MGB PCR 检测方法的建立及应用

郑 敏，张世忠，王 劭，谢开春，江丹丹，肖世峰,2，陈少莺,2*，邓国华

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013；3.福建省南平市延平区畜牧兽医水产局，福建 南平 353000；4.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

嵌杯病毒科（Caliciviridae）病毒粒子一般呈球形或近球形，核衣壳呈二十面体对称，直径27 nm～40 nm。嵌杯病毒为单股、正链RNA 病毒，其基因组约为7.4 kb～8.4 kb[1]。禽类嵌杯病毒根据非结构蛋白与衣壳蛋白氨基酸序列遗传变异关系通常可划分为两个属：Bavovirus 与Nacovirus[2-4]，基因组包含2 个开放阅读框（ORFs），靠近基因组5'端的ORF1 具备编码病毒非结构蛋白（NS）的功能，NS 蛋白裂解成N 末端蛋白（Nterm）、核苷三磷酸酶（NTPase）、3A 样蛋白、VPg、蛋白酶（Pro）和RNA 聚合酶（Pol）。2016 年张大丙等借助宏基因组测序从肠炎患鹅的肠道病料样品中检测到一种新基因型水禽嵌杯病毒株H146，暂命名为Sanovirus 属鹅嵌杯病毒（Goose calicivirus，GCV），与Nacovirus 属成员NS 蛋白的同源性仅为31%～34%[5]，与Sanovirus 属钻水鸭源嵌杯病毒株MW20 的Nterm 蛋白相比，GCV H146 株的Nterm 蛋白存在170 个不连续的氨基酸缺失。水禽嵌杯病毒NTPase 氨基酸序列较为保守，具有NTP酶活性和解旋酶活性，可以促进子代病毒复制[3-5]。2018 年至今，本实验室利用随机扩增的方法从福建各地区发生痛风的鹅中相继检测出一种新的GCV 株，该病毒株与鹅肠炎型GCV H146 株同源性很高，因此被命名为H146-like GCV[6]。国内对H146-like GCV 在放牧鹅群中的发病特点、传播途径及流行趋势等方面的研究工作还处于起步阶段。因此，采用合适的检测方法加强对H146-like GCV 的流行病学监控，对鹅病毒性肠炎与痛风的早期防治具有重要意义。

目前水禽嵌杯病毒实验室检测主要通过常规PCR 与测序进行[7-8]，这些常规方法与荧光定量PCR检测方法相比，操作繁琐且检测耗时长。荧光定量PCR 具有灵敏度高、特异性好、可靠性强和实时准确等特点，且PCR 结束后可以直接观察实验结果，降低了开盖点样造成污染的可能性[9-12]。国内外已经建立了检测多种嵌杯病毒的荧光定量PCR 方法[13-15]，在嵌杯病毒的实验室检测方面展示了良好的应用前景。分子流行病学分析表明，Sanovirus 属H146-like GCV 在自然宿主中的流行近年来呈现上升趋势[2,6]，因此，本研究针对GCV NS 基因的保守区域设计引物，建立一种可以特异性检测H146-like GCV 的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 检测方法，为监测水禽嵌杯病毒的流行状况以及GCV 的鉴别检测、定量分析提供可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸及病料样品鹅星状病毒（GoAstV）、鹅副粘病毒（GPMV）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHAV-1）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）等病毒基因组核酸样品以及H146-like GCV 阳性雏鹅肾组织样品均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室鉴定并保存。62份疑似感染H146-like GCV 雏鹅病料（包括肝、脾、肾和肠道等组织样品）为本实验室2018 年～2019 年采集自福建不同地区鹅养殖场。

1.2 主要试剂Premix TaqTM、PrimeScriptTMRT re⁃agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、Pre⁃mix Ex TaqTM、pMD18-T 载体、大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司；QIAamp MinElute Virus Spin Kit 病毒DNA/RNA 共提取试剂盒购自Qiagen 公司；DNA 回收纯化试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自美国Omega 公司。

1.3 引物和探针的设计参照GenBank 中GCV H146 株基因序列（KY399947）进行比对分析，选择其NS 基因保守区域，利用Oligo 6.0 和Express 3.0 设计常规RT-PCR 特异性引物GCV-P1/GCV-P2 以及荧光定量RT-PCR 特异性引物GCV-QP3/GCV-QP4 与TaqMan-MGB 荧光探针（GCV-Probe）（表1），探针5'端标记FAM，3'端标记MGBNFQ，预期扩增目的片段分别为269 bp和134 bp。引物与探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 引物和探针序列Table 1 Primers and TaqMan probe sequence used in this study

1.4 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成将经随机引物PCR 方法鉴定为GCV 感染的鹅痛风肾脏组织样品进行研磨，与灭菌PBS 充分混匀，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清。利用病毒DNA/RNA 共提取试剂盒提取病毒总RNA，并将其反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。

1.5 荧光定量PCR 方法的建立

1.5.1 标准品的制备 以H146-like GCV cDNA 为模板，按照Premix TaqTM说明书，以GCV-P1/GCV-P2引物进行常规PCR 扩增。常规PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，30 个循环，72 ℃5 min。PCR 产物纯化回收后克隆于pMD18-T 载体，构建重组质粒pMD-GCV，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。测序正确的重组质粒作为标准品，用核酸蛋白分析仪测定阳性质粒的OD260nm值，并根据阿弗加德罗常数计算单位体积中质粒的拷贝数为5.07×1010拷贝/μL，-20 ℃保存阳性质粒标准品。

1.5.2 荧光定量PCR 反应条件的优化及标准曲线的建立 按照荧光定量试剂盒说明书配制20 μL 的反应体系，通过温度梯度PCR 以不同退火温度（52 ℃～65 ℃）进行TaqMan-MGB 荧光定量PCR 反应确定引物的最适退火温度，采用矩阵法对引物浓度（5 μmol/L～20 μmol/L）和 探 针 浓 度（1.25 μmol/L～20 μmol/L）进行优化，最终获得最适合的探针与引物的浓度配比以及反应条件。将重组质粒标准品10倍倍比稀释至浓度为5.07×109拷贝/μL～5.07×101拷贝/μL，以其为模板，采用优化后的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法进行扩增，绘制动力学曲线及标准曲线。

1.6 特异性试验以GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等病毒的cDNA 或DNA 为模板，采用本实验建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 扩增，以检测该方法的特异性，同时以灭菌ddH2O 为阴性对照，H146-like GCV cDNA 为阳性对照。

1.7 敏感性试验将标准质粒做10 倍倍比稀释，以10个不同稀释度（5.07×109拷贝/μL～5.07×100拷贝/μL）的质粒标准品分别为模板进行TaqMan-MGB 荧光定量PCR 扩增，以灭菌ddH2O 为阴性对照，分别利用本研究建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 和1.5.1 中常规PCR 方法进行检测，以评估该方法的敏感性。

1.8 重复性试验分别以同一批次和不同批次制备的不同拷贝数（5.07×108拷贝/μL、5.07×107拷贝/μL、5.07×106拷贝/μL）标准品作为模板，用优化后的条件分别进行组内和组间重复性试验，每个模板分别做3 个重复，计算批内及批间重复性试验的变异系数（CV）。

1.9 临床样品的检测对本实验室采集的62 份疑似H146-like GCV 感染雏鹅的肝脏、脾脏、肾脏、肠道等样品，以灭菌PBS 研磨，反复冻融3 次后取上清，提取样品总RNA 后，反转录为cDNA，以其为模板，同时利用本研究建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法和1.5.1 中常规PCR 方法对62 份临床样品核酸进行检测，比较二者检测结果，并计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 荧光定量PCR 反应条件优化结果优化后的荧光定量TaqMan-MGB PCR 最佳反应体系（20 μL）如 下：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）混合液10 μL、上、下游引物GCV-QP3/GCV-QP4（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（GCV-Probe）（5 μmol/L）1 μL、模板1 μL、无RNase 水补足至终体积20 μL。优化的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法最佳反应参数为：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃20 s，40个循环。

2.2 标准曲线的建立将pMD-GCV 标准品10 倍倍比稀释后作为模板经建立的荧光定量PCR 检测，结果显示，该标准曲线在5.07×109拷贝/μL～5.07×102拷贝/μL 8 个不同浓度范围内与Ct 值具有良好的线性关系，相关系数0.995（图1）。标准曲线的斜率为-3.5579，截距为33.75，直线方程为：y=-3.5579x+33.75。

图1 H146-like GCV 荧光定量PCR 扩增动力学曲线与标准曲线（单位：拷贝/μL）Fig.1 Amplified kinetic curve and standard curve of H146-like GCV real-time PCR (Unit: copies/μL)

2.3 特异性试验结果采用建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法对GoAstV、GPMV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 等 病 毒 的cDNA 或DNA 进 行 检测，以H146-like GCV cDNA 为阳性对照。结果显示，建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 检测方法仅对H146-like GCV 呈现阳性扩增，而灭菌ddH2O 对照和其它病毒扩增结果均为阴性（图2），表明本研究建立的检测方法具有较强的特异性。

图2 H146-like GCV 荧光定量PCR 特异性试验结果Fig.2 The specificity for H146-like GCV real-time PCR

2.4 敏感性试验结果对质粒标准品10 倍倍比稀释后作为模板，分别采用TaqMan-MGB荧光定量PCR和常规PCR 方法进行检测，结果显示，TaqMan-MGB荧光定量PCR 方法能检测的质粒标准品最低浓度为5.07×102拷贝/μL，而常规PCR 方法最低检测浓度为5.07×104拷贝/μL（图3），灭菌ddH2O阴性对照无扩增，TaqMan-MGB 荧光定量检测方法比常规PCR 方法敏感100 倍，表明本研究建立的方法具有更高的敏感性。

图3 GCV 荧光定量PCR(A)和常规PCR 方法(B)的敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity test of the GCV real-time PCR (A) and the conventional PCR (B)

2.5 重复性试验结果用3 种浓度的质粒标准品（5.07×106拷贝/μL～5.07×108拷贝/μL）分别进行批次内和批次间的重复性试验。结果显示，批内和批间重复性试验的变异系数均小于1.6%（表2），表明建立的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法具有良好的重复性与稳定性。

2.6 临床样品检测利用建立的GCV TaqMan-MGB荧光定量PCR 方法对62 份临床样品进行检测，荧光定量PCR 测结果显示阳性样品58 份，检出率为93.5%，常规PCR 检测结果显示阳性样品45 份，检出率仅为72.6%；常规PCR 检测为阳性的45 份样品经TaqMan-MBG 荧光定量PCR 方法检测均为阳性，二者的符合率为77.59%（表3），表明建立的Taq⁃Man-MGB 荧光定量PCR 方法可用于临床样品中GCV的检测，且比常规PCR 方法敏感。

3 讨 论

近年来，中国、美国、加拿大、巴西等多个国家均报道称通过宏基因组等技术发现健康候鸟与涉禽个体可以携带Nacovirus 属和Sanovirus 属的水禽嵌杯病毒[2-3,6-8]。国家水禽产业技术体系疾病防控研究室于2014 年报道了我国健康鹅群中存在Nacovirus 属GCV，2014 年至今国内外研究人员对水禽嵌杯病毒分子流行病学调查以及病毒株基因序列分析表明，Sanovirus 属GCV 是引起我国鹅病毒性肠炎与传染性生长阻滞综合征的重要病原之一[3,6,16-17]。目前H146-like GCV 与其它肠道病毒的共感特性及其染机制尚不清楚，为了解GCV 在我国鹅群中的感染情况，建立一种便捷、准确、可靠的实验室检测方法具有重要意义。

表2 H146-like GCV 荧光定量PCR 重复性试验结果Table 2 Reproducibility assay of H146-like GCV real-time PCR

表3 TaqMan-MGB 荧光定量PCR 方法与常规PCR 检测结果及符合率Table 3 Detection results and coincidence rate of TaqMan-MGB real-time PCR and conventional PCR

TaqMan-MGB 探针特异性好，敏感性更高，张秀娥等用MGB 探针和普通探针荧光定量PCR 方法检测兔病毒性出血症病毒，发现MGB 探针定量范围更宽[18]。本实验设计的探针为MGB 探针，MGB 可以显著增强探针与模板的结合能力，提高探针的Tm值，使探针的长度缩短，结合效率提高，尤其对于GCV NS 基因中AT 含量较高的序列，MGB 探针的设计更具有优势。MGB 探针的3'端的淬灭基团标记不发光的NFQ 荧光基团，可极大消除传统淬灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，使反应的背景值更低，增加了反应的特异性，提高了扩增效率[19-20]。

本研究根据H146-like GCV 基因组的保守基因NS 设计特异性的引物和MGB 探针，建立了检测GCV 的TaqMan-MGB 荧光定量PCR 检测方法，该方法对于GCV 的检测结果为阳性，对GoAstV、GP⁃MV、GPV、MDRV、DHAV-1、DTMUV 核酸样品的检测结果均为阴性。经测序分析表明，TaqMan-MGB 荧光定量检测方法扩增的GCV NS 基因PCR 目标序列与参考序列同源性为93.3%～100%；批间、批内各组变异系数均低于1.6%，显示了该方法良好的特异性、稳定性与可靠性。采用本研究建立的Taq⁃Man-MGB 荧光定量PCR 方法对临床疑似GCV 感染的病料样品进行检测，其检测结果与常规PCR 符合率为77.59%，表明针对NS 基因建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR 方法可为H146-like GCV 的快速检测及其流行病学调查提供有力的技术支持。