绵羊肺炎支原体对人肺泡II 型上皮细胞活性及炎症反应的影响

高力扬，张 颖，陈方正，李小杰，马金成，马小明，赵琰龙，李 敏*

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起绵羊传染性胸膜肺炎的主要致病菌，从1963 年首次发现该病原菌至今[1]，这种支原体在各大洲养殖羊及野生羊中均有检出[2]，MO 对全球绵羊养殖业危害极大。大量文献报道显示：肺炎支原体能够引起宿主呼吸道损伤并造成免疫缺陷，但与其他支原体相比，MO 的致病机理的研究非常有限[3]。有报道显示在正常羊呼吸道中也能够检测出MO[4]，提示MO广泛存在于饲养环境中。因此，养殖户在处理支原体肺炎病羊时会直接接触到MO，虽然目前未见MO 引起人的病例报道，但MO 对人体是否存在潜在影响尚不能确定，近年来关于致病菌跨种属感染的病例报道越来越多，因此有必要研究MO 对人体是否存在潜在危害。肺泡上皮细胞与病原体直接接触，一旦激活后会释放细胞因子参与肺部炎症反应，而且肺泡上皮细胞的损伤是肺炎发展的关键步骤[5]。因此，本研究以MO 感染后的人肺泡II 型上皮细胞为细胞模型，为MO 感染对人呼吸系统可能存在的潜在影响进行评估。

1 材料与方法

1.1 细胞株及MO株肺泡II型上皮细胞系HPAEpiC购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MO 标准株Y98 由宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保存。

1.2 主要试剂lncRNA RP11-29G8.3-001 过表达病毒由汉恒生物合成并构建；腺病毒表达载体pH⁃BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 购自汉恒生物科技（上海）有限公司；本实验所用引物均由Sangon Biotech 公司合成。胎牛血清和DMEM 均购自美国Gibco 公司；反转录试剂和Premix Ex TaqTMII 购自Ta⁃KaRa 公 司；TRIzol 裂 解 液、CellTiter-LumiTM发 光 法检测试剂盒、CCK-8 细胞增殖检测试剂盒、DIO 细胞膜绿色荧光染色试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。lncRNA 芯片购自博奥晶典生物技术公司。

1.3 MO Y98 株感染细胞模型的建立选取MO 标准株Y98，采用改良Hayflick 支原体培养基（20%马血清）[6]，于37 ℃恒温培养，直至培养基由红变黄，MO浓度为1×106ccu/mL。将生长状态良好的人肺泡II型上皮细胞HPAEpiC以1×105个/mL接种于60 mm细胞培养皿中，于37℃、5%CO2培养48 h，待细胞融合度达75%左右时，利用MO Y98 株感染细胞24 h，感染复数（MOI）为10。利用DIO 对MO 细胞膜进行荧光染色，然后利用免疫荧光技术鉴定人肺泡II 型上皮细胞的感染状况。

1.4 细胞增殖及活力影响的检测将人肺泡II型上皮细胞以1×104个/孔接种于96孔板，待细胞融合度达到80%时加入MO Y98 株感染24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h 后，测定其OD450nm值，确定MO Y98 感染对细胞增殖的影响；取出细胞培养板室温平衡10 min，每孔加入100 μL Cell Titer-LumiTM发光法检测试剂，室温下振荡2 min 后室温孵育10 min，利用多功能酶标仪进行化学发光检测，确定MO Y98 感染对HPAEpiC 细胞ATP 生成量的影响。

1.5 细胞形态变化检测本实验采取扫描电镜检测感染MO 后的人肺泡II 型上皮细胞形态变化。具体操作步骤为：检测前按1.3 中的方法制作被MO 感染的细胞爬片，采用预冷的2.5%戊二醛/PBS 溶液过夜固定，利用50%、70%、85%、95%、100%乙醇溶液梯度脱水，然后用叔丁醇置换3次，每次10 min，最后冷冻干燥后经扫描电镜观察感染后人肺泡II 型上皮细胞形态变化情况。

1.6 MO 感染人肺泡II 型上皮细胞后相关基因表达及转录水平的检测利用TRIzol 裂解后提取无感染组及MO 感染组细胞总RNA，委托博奥晶典生物技术公司利用lncRNA 芯片对细胞mRNA 长链非编码RNA（lncRNA）进行筛查检测。利用RT-qPCR 方法对芯片筛选到的基因进行初步验证，筛选出表达显著上调的基因。并利用qPCR 对炎症因子相关基因IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7 的转录水平进行检测（引物序列见表1）。

1.7 lncRNA RP11-29G8.3-001 过表达对MO 感染人肺泡II 型上皮细胞的影响分析进一步选择与MO感染相关且表达上调的基因lncRNA RP11-29G8.3-001开展基因过表达及免疫相关基因的检测。具体方法为：合成lncRNA RP11-29G8.3-001 的cDNA 序列（En⁃sembl GRCh37.p13 获得），插入腺病毒表达载体pH⁃BAd-EF1-MCS-CMV-EGFP-Δloxp 中，重组病毒的构建及纯化由汉恒生物科技（上海）有限公司完成；将含有lncRNA RP11-29G8.3-001 表达质粒的腺病毒加入细胞融合度达到70%的人肺泡II 型上皮细胞，病毒最佳MOI 为100。置于细胞培养箱中孵育6 h～8 h 后，利用荧光显微镜观察细胞中GFP 的表达情况，然后换新鲜培养液继续培养细胞至90%以上融合后，收集细胞用于后续试验。qPCR 检测lncRNA RP11-29G8.3-001的转录水平，及lncRNA RP11-29G8.3-001过表达后细胞中免疫相关基因HLA-B、HLA-F、HLA-C、IF16、IF127、IF135、IFITM1、IFITM3、OAS1、OAS3的转录水平（表1）。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers for RT-qPCR

1.8 生物信息学分析及统计学方法实验数据采用Graphpad Prism 7 软件进行分析，采用T 检验，p<0.05 有统计学意义。

2 结 果

2.1 MO 感染人肺泡II 型上皮细胞模型的建立为了证实MO 感染人肺泡II 型上皮细胞模型的建立，本研究采用荧光法检验MO 在细胞中的分布情况。激光共聚焦显示，DIO 荧光染色的MO 在感染人肺泡II 型上皮细胞12 h 内会进入细胞质基质中，并围绕细胞核分布（图1）。这一现象表明建立的MO 感染模型可用于后续试验。

2.2 MO 对人肺泡II 型上皮细胞细胞增殖及活力的影响为了研究MO 在体外对人肺泡II 型上皮细胞增殖及细胞活力的影响，本实验采用CCK-8 及CellTiter-LumiTM发光法对细胞增殖和细胞活力进行检测，结果显示MO 感染的细胞与对照两种细胞的数量及ATP 产生量无显著影响（图2），结果提示MO感染对人肺泡II 型上皮细胞没有显著毒性，且不会降低该细胞的活性。

图2 MO 对人肺泡II 型上皮细胞增殖及活性的影响Fig.2 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on cellproliferation activity of human alveolar type II epithelial cells

2.3 MO对细胞形态的影响为了观察MO 感染人肺泡II 型上皮细胞后的形态变化，本实验采用扫描电镜进行观察，结果显示：人肺泡II 型上皮细胞在感染MO 后会伸出很多伪足（图3），推测MO 刺激细胞后伸出的伪足可能是MO 进入细胞质基质的原因。

图3 MO 对肺泡上皮细胞形态的影响Fig.3 The morphology of infected human alveolar epithelial cells

2.4 MO 感染人肺泡II 型上皮细胞中相关基因表达及转录水平的检测为了进一步检测MO 感染后的细胞基因表达的变化，利用基因芯片对细胞中mRNA 及lncRNA 进行筛查，并采用荧光定量PCR 进行验证。 RT-qPCR 结果显示MO 感染会引起人肺泡II 型上皮细胞中SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及ln⁃cRNA RP11-29G8.3-001 转录水平的显著上调（p<0.05，图4A），但是MO 感染不会上调人肺泡II 型上皮细胞中炎性因子的转录水平，如IL-1β、TNF-α、IFN、IRF7（图4C）。结果表明MO 感染虽然会上调人肺泡II 型上皮细胞内极少数蛋白编码基因的表达（SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1），但这些基因均与细胞炎症反应、细胞凋亡无关；且MO 感染不会直接诱导肺泡上皮细胞炎症因子的表达。

2.5 lncRNA RP11-29G8.3-001 过表达对MO 感染人肺泡II 型上皮细胞的影响分析MO 感染会引起lncRNA RP11-29G8.3-001 转录水平升高（p<0.05，图4B），但lncRNA RP11-29G8.3-001 的作用目前未见报道。为了进一步探索lncRNA RP11-29G8.3-001在人肺泡II 型上皮细胞中的作用，本实验利用携带lncRNA RP11-29G8.3-001 表达质粒的腺病毒感染HPAEpic 细胞。qPCR 检测结果显示lncRNA RP11-29G8.3-001 表达上调超过6 倍以上（图5），本研究将肺泡II 型上皮细胞分为两组，lncRNA RP11-29G8.3-001 基因过表达和MO 感染组。人RP11-29G8.3-001过表达会引起HLA-B、HLA-F、HLA-C 的转录水平显著降低（图6Ai），且抗感染相关基因IFITM1、IF⁃ITM3、OAS1、OAS3 等转录水平均显著降低（图6Aii）。然而体外MO 感染（MOI 10）感染仅能上调ln⁃cRNA RP11-29G8.3-001 表达1.5 倍，不足以引起上述免疫相关基因转录水平发生变化（图6B）。实验结果表明，虽然lncRNA RP11-29G8.3-001 过表达可引起人肺泡II 型上皮细胞的免疫抑制，但本实验中MO 感染（MOI 10）引起的少量lncRNA RP11-29G8.3-001 表达并没有造成免疫相关基因转录水平的下降，推测相关基因的转录水平可能与lncRNA RP11-29G8.3-001 的表达水平有关。

3 讨 论

以往研究显示，肺炎支原体可以通过对宿主细胞的黏附、膜融合、营养剥夺、侵入、毒力因子等作用直接损伤宿主细胞[7]。但本实验通过CCK-8 及细胞ATP 水平检测等手段，发现MO 感染人肺泡II型上皮细胞48 h 后，感染组及对照组细胞数量及细胞活性并无明显改变，推测MO 感染可能不会引起人肺泡II 型上皮细胞增殖能力降低甚至死亡。利用DIO 荧光染色的MO 感染人肺泡II 型上皮细胞，发现MO 可以进入细胞质基质中，而且扫描电镜结果发现MO 感染会促进人肺泡II 型上皮细胞伸出伪足，推测MO 可能利用胞饮进入细胞。而支原体和细胞膜成分相似，这可能也是MO 进入细胞的一个途径。

图4 MO 感染对人肺泡II 型上皮细胞中基因表达的影响Fig.4 The effect of Mycoplasma ovipneumoniae on gene expression of human alveolar type IIepithelial cells

图5 lncRNA RP11-29G8.3-001 在人肺泡II 型上皮细胞中的表达量变化Fig.5 Expression of lncRNA RP11-29G8.3-001 in human alveolar type II epithelial cells

有研究显示鸡毒支原体脂质相关膜蛋白会上调鸡气管上皮细胞中IL-1β 的表达，而肺炎支原体感染可上调人肺泡II 型上皮细胞中IL-1、TNF 的表达[8]，并且ROS 可通过上调TNF-α 增加对肠上皮细胞的损伤[9]。有研究发现甲型流感病毒基质蛋白1、2 可以诱导小鼠气管上皮细胞产生IFN-γ，提示IFN-γ 与气管上皮细胞免疫有关[10]。而IRF7 则参与支气管上皮细胞抗病毒免疫、炎症及氧化应激反应相关基因的表达[11]。上述病原体感染均可引起炎症因子上调。上述炎症因子均与上皮细胞免疫有关。本实验发现MO 可以进入细胞，但细胞中IL-1β，TNF-α，IFN，IRF7 等炎症因子的表达并无明显变化，MO 感染不会引起人肺泡II型上皮细胞炎症因子表达变化。

为了进一步研究MO 对人肺泡II 型上皮细胞的潜在影响，本研究采用基因芯片进行差异基因筛选，共检出3 个mRNA 及5 个lncRNA 在MO 感染的细胞中表达上调，qPCR 验证后证实SCNN1G、LOX、ST6GALNAC1 及lncRNA RP11-29G8.3-001 表达显著上升。但利用OMIM 数据库分析发现，除上皮钠通道γ 亚基外（由SCNN1G 基因编码），LOX 和ST6GALNAC1 均与呼吸系统疾病无相关性。而上皮钠通道γ 亚基表达升高对肺水转运有促进作用，可以减少肺水肿的发生[12]。

反义lncRNA RP11-29G8.3 基因存在于第13 号染色体上（Ensembl GRCh37.p13 版本），目前功能尚不清楚。人肺泡II 型上皮细胞中lncRNA RP11-29G8.3-001 在MO 感染后表达显著升高，提示其在感染中可能存在一定作用，因此本实验采用基因过表达的方法验证其功能。结果显示lncRNA RP11-29G8.3-001 可以显著下调HLA-B、HLA-F、HLA-C等基因的表达，并且显著抑制抗感染因子OAS1、OAS3 等基因表达。人HLA-B、HLA-C 基因编码主要组织相容性复合物I 类（MHC-I），HIV 可以通过抑制MHC-I 的表达而逃避免疫清除。而IFI6 可以通过线粒体依赖途径抑制登革2 型病毒感染血管内皮细胞凋亡[13]，提示IFI6 在抗病毒、抗凋亡中发挥作用。IFITM1、IFITM3 可以通过抑制病毒包膜与宿主细胞膜的融合，从而抑制丙型肝炎病毒进入细胞[14]。OAS1 和OAS3 作为人类巨噬细胞中趋化因子和干扰素应答基因表达的负调节剂，是抗病毒反应系统的介质[15]。这些抗感染相关基因表达下调与ln⁃cRNA RP11-29G8.3-001 负相关，提示lncRNA RP11-29G8.3-001 可能参与细胞免疫抑制。然而与基因过表达相比，体外大剂量MO 感染（MOI 10）并不能大幅上调人肺泡II 型上皮细胞中lncRNA RP11-29G8.3-001 的表达量，而低水平的lncRNA RP11-29G8.3-001不会对细胞产生显著的免疫抑制作用，因此MO 通过大幅上调lncRNA RP11-29G8.3-001 造成人肺泡II型上皮细胞免疫抑制的可能性极小。

图6 人肺泡II 型上皮细胞中免疫相关基因转录水平的检测Fig.6 Expression of immune-related genes inhuman alveolar type II epithelial cells

综上所述，MO 是造成绵羊传染性胸膜肺炎的主要病原菌，可以通过飞沫等途径传染，对绵羊养殖业危害极大，但这种支原体是否会对人体产生潜在影响，尚无理论依据。本研究通过建立MO 感染肺泡上皮细胞模型，从细胞活性及基因表达等方面评估了MO 对人体的潜在危险，研究发现MO 对人肺泡上皮细胞的影响有限，造成损害的可能性较小。