云南省腾冲市牛、羊中无形体感染的分子流行病学调查

沈雪鹰，蒋宝贵，何志海，孙 毅，傅国璋，姚明国，张 云，江佳富，杜春红*

（1.云南省地方病防治所，云南 大理 671000；2.云南省腾冲市动物疫病控制中心，云南 腾冲 679100；3.军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，北京 100071；4.大理大学公共卫生学院，云南 大理 671000）

无形体是隶属于立克次体目（Rickettsiales）无形体科（Anaplasmataceae）无形体属（Anaplasmas）的一类革兰氏阴性细胞内寄生菌，不同种的无形体可分别侵袭人和动物粒细胞、单核细胞、红细胞和血小板，导致人和动物无形体病。人类和多种小型兽类、野生动物和家畜均可成为无形体的感染者和/或宿主，成为重要传染源，并通过节肢动物蜱等叮咬，或破损皮肤黏膜接触含病原体的体液、血液进行传播[1]。无形体属种类多，主要有嗜吞噬细胞无形体（A.phagocytophilum）、山羊无形体（A.capra）、绵羊无形体（A. ovis）、边缘无形体（A. marginale）、中央无形体（A. centrale）、牛无形体（A. bovis）和血小板无形体（A. platys）等，主要感染牛、羊、犬和鹿等哺乳动物，其中A. phagocytophilum、A. capra 和A. ovis 变异种可以感染人类[2-7]。无形体感染后可出现不同症状，人类主要以发热伴白细胞、血小板减少和多器官功能损害为主，可伴有头疼、肌痛等症状。动物主要表现为发热、贫血、黄疸、大量流涎和体重减轻等，部分发生流产，重则发生死亡[8]。无形体疾病是一种严重影响人类健康和养殖业发展的人兽共患自然疫源性疾病。

腾冲市位于云南省西部边陲，为古代“南方丝绸之路”的极边重镇，畜牧业产值达23.29 亿元，占农业总产值的47.7%。作为云南省的重要边境县市，有148 公里国境线，有3 个乡镇与缅甸接壤。有国家级口岸猴桥口岸，省级口岸滇滩、自治口岸，还有16 条民间交往通道。中缅两国自古民间贸易往来密切，民间交流频繁。由于动物疫病防控的需要，我国禁止与东南亚国家的偶蹄动物贸易。目前没有通过正规渠道入境的偶蹄动物，但通过民间小道走私入境的情况偶有发生。另外由于腾冲与缅甸有较长的国境线，中缅双方边民交叉放牧牛羊的情况也时有发生，放牧过程中也发生一些牲畜的交换、交易。目前，长期在边境游牧的牛羊约有12 群600 余头（只）。边民的牛羊混牧也给疫病和寄生虫交互感染提供了机会。云南省既往调查也显示, 家畜、犬等家养动物和小型兽类中存在无形体感染。为了解本地区养殖家畜感染无形体的状况，加强动物疫病防治，本研究对本地区多个乡镇养殖的牛、羊进行无形体病调查，旨在为该地区牛羊养殖与流行病学防治提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 血液样本及主要实验材料牛、羊血样758 份，其中牛血样331份，羊血样427份，分别采集于云南省腾冲市曲石、滇滩、中和、猴桥、界头、芒棒、腾越、明光、荷花、固东、蒲川等11个乡镇，采样区分布见图1。采集方式为无菌采集动物颈静脉血。

图1 调查样本采集区分布图Fig.1 Distribution of sampling area

血液基因组DNA 提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，lot：03625）购自天根生化科技（北京）有限公司；DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DL2000 DNA Marker购自TaKaRa Bio 公司。

1.2 血液样本中无形体16S rRNA 的PCR 扩增利用血液基因组DNA 提取试剂盒提取血液样品DNA。参照文献[9-10]，采用半巢式PCR 扩增无形体16S rRNA 基因，预计扩增片段660 bp。PCR 扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并经生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定。

1.3 16S rRNA 基因序列分析及无形体种类的鉴定与统计利用CLC Genomics Workbench 3.6.1 将所得序列进行序列拼接。利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具将测序结果与GenBank 中相关基因序列比对分析，进行无形体种的确定。根据无形体种类鉴定标准，以种间序列相似性 99%，结合不同来源等生态学特征，判定为同一种无形体。利用MEGA6.06 软件，邻接法Neighbor-Joining、Kimura 2-parameter model、bootstrap 1000 构建系统发育树，对获得的阳性样本序列进行遗传进化分析。

2 结果与讨论

2.1 腾冲市各乡镇牛、羊感染无形体的情况本实验共检测11 个乡镇的家畜血样758 份，检出阳性样品255 份，总阳性率为33.64%。其中羊血样本427份，检出阳性114 份，阳性率为26.69%；牛血样本331 份，检出阳性141 份，阳性率为42.60%；11 个乡镇中，有8 个乡镇的羊血检出阳性，阳性率从高到低依次为蒲川乡（76.19%）、界头镇（55.00%）、荷花镇（53.33%）、猴桥镇（21.05%）、滇滩镇和明光镇（20.00%）、曲石镇（10.81%）、中和镇（10.61%）；采样的全部乡镇的牛血样本均检出阳性，阳性率在10.00%～100.00%，部分样本的检测结果见图2。结果表明，腾冲市牛、羊中无形体的感染率较高，流行地区分布广泛。羊血阳性率>50%的有3 个乡：蒲川乡、界头镇和荷花镇，牛血阳性率最高的是猴桥（100%）和腾越镇（95.74%），猴桥镇某养殖户的20头牛血样本，全部检出阳性，腾越镇某养殖户的47头牛血样本45 头检出阳性。而这些乡镇大多为山区、半山区，感染率高可能与周边森林植被覆盖率高，气候湿润，易孳生蜱虫、牛虻、厩蝇、蚊等吸血昆虫有关。

蜱虫因其复杂的生活史、较强的抗逆性、对病原体复杂的传播模式和广泛的宿主谱，使其成为许多自然疫源性疾病的传播媒介和储存宿主，是近年来比较受关注的媒介之一。其中立克次体病是一种重要的蜱传疾病，也是影响畜牧业发展的一类重要疾病。立克次体科无形体属病原体主要宿主是野生哺乳动物如野猪、鹿、刺猬、啮齿动物等，以及家养动物如羊、牛、犬、马等。而动物宿主的持续感染是病原体维持自然循环的基本条件。云南省既往研究显示，多地野生动物和家畜中均存在无形体病的流行[11-14]。本研究结果提示，腾冲市为无形体病的潜在自然疫源地，而且具有病原体种类复杂、分布广泛的特点，这些病原体可通过蜱虫叮咬在动物之间甚至是动物与人之间传播，对人群和家畜健康产生危害。因此，在发展养殖业的同时，需加强无形体病的防治工作，倡导家畜圈养、注意动物体表寄生虫的杀灭，从业者提高防范意识，进入林区和饲养家畜时，避免被蜱虫等叮咬。兽医要提高对无形体病的认识，早期发现和治疗病畜，加强流动家畜的检验检疫，控制疾病的传播。

图2 部分样本的PCR 扩增结果Fig.2 Partial results of PCR amplified

2.2 腾冲市牛、羊感染无形体的种类根据所得16S rRNA 基因序列与GenBank 中登录的该基因序列进行同源性比对，本次调查共检出7 种无形体，包括：A.centrale、A. ovis、A. platys、A. capra、A. margi⁃nale、A. phagocytophilum 和A. bovis。其中羊检出除A. centrale 外 的6 种 无 形 体 共114 份，以A. ovis（占63.16%，72/114）和A. platys（占21.93%，25/114）为主。牛检出除A. capra 外的6 种无形体共138 份，以A. marginale（占46.10% ， 65/141）和A. platys（占36.88%，52/141）为主。A. platys 是当地牛、羊均能感染且感染率较高的一种无形体，共检出77 份阳性，11 个乡镇均有分布；A. marginale 主要在9 个乡镇的牛血中检出，羊血仅检出1 份；A. ovis 主要感染羊，在8 个乡镇的72 头羊血样中检出阳性，主要集中在界头镇和蒲川乡，牛检出6 份阳性。本研究还在牛和羊血中检出A. phagocytophilum 19 份、羊血中检出A. capra 1 份，这两种无形体是目前已确认对人有致病性的2 个种[8]。

以上结果表明，腾冲市牛和羊感染的无形体种类极为丰富，几乎涵盖了目前所确定的全部无形体种类。羊以感染A. ovis 和A. platys 为主，牛以感染A. marginale 和A. platys 为主，A. platys 是在当 地 牛 和和羊中共同流行的一个种。虽然检出的部分种类如中央无形体是弱病原性虫种，但其可致体弱的个体、新生个体发病；A. ovis、A. bovis、A. platys 和A.marginale 等均可引起流行，影响家畜的繁殖和奶、肉产出，甚至导致动物死亡。临床上牛常发生持续隐性感染，甚至终生隐性感染而成为重要传染源[15]。同时，本调查还在1 份羊血中检出A. margi⁃nale，在6 份牛血中检出A. ovis，部分样本不能确定种类，如TC-729。可能因当地牛、羊携带的无形体病原体具有基因多样性较高的特征，加之立克次体基因组高度保守，导致少部分样本采用单一基因序列分析会影响其种属分类。后续还需对这些样本，尤其是致病性较强的A.phagocytophilum，A. capra 等进行多位点分析，如rrs、gltA、ompA、ompB 等，以提高种属的可靠性并了解病原体的特征。

2.3 感染无形体的16S rRNA 基因序列分析将经PCR 扩增的16S rRNA 基因与GenBank 中登录的核苷酸序列进行同源性比较，检出的7 种无形体与相应无形体种类的同源性在98%～100%。以立氏立克次体（Rickettsia rickettsii，DQ150682）为外类群构建系统发育树。结果显示，山羊、奶水牛、水牛和黄牛中检出的A. platys 种间差异较小，进化关系聚在一个分支，与非洲和东南亚检出的序列亲缘关系较近，部分样本遗传距离稍远（图3）。在当地牛和羊中检出的A. bovis、A.ovis、A. marginale、A. centrale，同种间序列同源性96.8%～100%，分别与国外、国内多省市检出的序列聚在一个分支。在牛和羊中检出对人致病的A. phagocytophilum，与其它地区蜱、狗、绵羊分离的16S rRNA 序列同源性>99%，与从韩国人血分离到的菌株（MH482862.1）同源性为99.77%。表明腾冲检出的A. phagocytophilum 对人致病的可能性较大。部分样本同种间存在一定差异，如黄牛TC-729，同源性比较与A. phagocytophilum、A. platys 和在南非牛血中检出的无形体同源性均为99.07%，但进化分析却独处一个小分支，处于A.phagocytophilum 和A. bovis 之间，是否单独为一个种类或亚种，还需进一步确认。这些结果表明，腾冲市牛、羊感染的无形体，在不同牛羊个体来源的同种无形体，16S rRNA 基因序列存在碱基差异、遗传距离不等的情况。

图3 基于无形体16S rRNA 基因构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic analysis based on 16S rRNA genes of Anaplasmosis

16S rRNA 存在于所有原核生物中，其具有较高拷贝量和序列中含有高度保守区，是无形体基因分类最常用的扩增靶基因[16-18]。本次调查可能因当地牛、羊携带的无形体病原体具有基因多样性较高的特征，导致少部分样本采用单一基因序列分析无法达到种属分型的要求。因此，对于分类不是太清晰的样本，尤其是致病性较强的A. phagocytophilum、A. capra，非常有必要进行多位点分型，以提高分型的可靠性，并进一步了解病原体的特征，为牛、羊感染不同无形体病的研究，以及对人类健康存在威胁的无形体种类的更深入认识提供参考依据。