甲磺酸伊马替尼增强ALA-PDT对皮肤基底细胞癌细胞杀伤作用研究

张东晨， 万学峰

(1.河北省保定市第一中心医院皮肤科， 河北 保 定 071000 2.新疆医科大学第一附属医院皮肤科， 新疆 乌鲁木齐 830054)

近些年临床采用5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)治疗日光性角化病、浅表型基底细胞癌和Bowen病等，是一种有效治疗浅表皮肤恶性肿瘤的方法。研究表明PDT治疗浅表型基底细胞癌、Bowen病和日光性角化病1年清除率约为65%～100%[1,2]，影响PDT疗效的重要因素之一是病变组织内卟啉物质的蓄积，通过增加卟啉物质在病变组织中的蓄积可提高PDT的疗效，运用该方法治疗不同类型的肿瘤是目前研究领域的热点。靶向性原卟啉IX(PpIX)的蓄积可通过药物前体ALAS旁路传递及抑制血红素生物合成终端酶亚铁螯合酶(FECH)而获取。同时通过螯合铁降低FECH的活性，增加该途径中前体药物诱导PpIX的蓄积。PpIX是一种底物以ATP依赖性药物外排泵ABCG2(BCRP/ABCG2)[3]，ABCG2蛋白主要位于细胞膜，也有报道位于线粒体内膜和细胞系的其它细胞内。ABCG2过度表达来源于人细胞系时可致细胞内PpIX的荧光降低，这与PDT疗效的降低相关联，当细胞孵育于含ABCG2抑制剂如烟曲霉毒素C[4,5]、Ko-134[6]或甲磺酸伊马替尼[7]时，可逆转ABCG2蛋白的过度表达。因此本研究采用人类细胞系(HaCaT表皮角质形成细胞，HSC-2基底细胞癌)，采用ALA处理上述细胞系，在有/无ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼时，对卟啉物质的蓄积、ABCG2蛋白的表达及细胞内卟啉物质的定位进行评价。

1 材料与方法

1.1一般材料

1.1.1细胞系:人角质形成细胞HaCaT和人皮肤基底细胞癌细胞HSC-2购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2主要试剂:细胞培养用DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco公司，抗体ABCG2(BS-0662R)购自于博奥森，抗体GAPDH(AB-P-R 001)购自于杭州贤至生物有限公司，HRP标记羊抗兔二抗(BA1054)购自于武汉博士德生物工程有限公司，磷酸酶抑制剂(S1873)、RIPA裂解液(P0013B)、PMSF(ST506)和BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)购自于碧云天，ECL底物液(NCI5079)购自于Thermo，人原卟啉(EPP)ELISA试剂盒(ml711200)购自于上海酶联，ALA购自于复旦张江生物制药股份有限公司，ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼(Imatinib)购自于诺华制药有限公司，荧光线粒体探针(MitoTracker-Green)购自于碧云天(C1048)。

1.2方 法

1.2.1细胞培养及分组干预方法:人HaCaT角质形成细胞保存于达尔贝科改良Eagles’s培养基，内含5%胎牛血清和1%非必需氨基酸，人基底细胞癌细胞HSC-2接种于RPMI培养基中，其含有10%FCS。细胞在具有5%CO2和饱和湿度的恒温培养箱中37℃恒温培养。分组为：HaCaT细胞/HSC-2细胞作为空白对照组，HaCaT细胞/HSC-2细胞+ALA组和HaCaT细胞/HSC-2细胞+ALA+甲磺酸伊马替尼作为实验组。细胞干预方法为：细胞密度达24×104cells/cm2时铺板，铺板后24h分别给予浓度为1mM ALA和1uM甲磺酸伊马替尼0.5ml，避光环境下孵育4h，处理上述细胞进行细胞蛋白提取、ELISA和细胞荧光染色试验。

1.2.2细胞蛋白的提取:六孔板培养细胞，在细胞长满的情况下每孔加入100μL含PMSF(100mM)的裂解液，于冰上裂解30min，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中，于4℃下12000rpm离心5min，将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存备用。

1.2.3蛋白浓度的测定:将蛋白样品进行10倍稀释，将BSA标准品进行稀释，制成蛋白浓度为1，0.8，0.6，0.4，0.2标准蛋白。将PBS稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50:1比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200μL。37℃避光孵育30min后，用DG-3022A酶标仪测定OD568，根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。

1.2.4Western blotting 半定量检测目的基因表达:SDS-PAGE凝胶电泳梯度分离目的蛋白后将目的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温摇床封闭2h，分别加入ABCG2(1:1000)和GAPDH(1:1000)抗体4℃孵育过夜，TBST冲洗6次，5min/次，加入HRP偶联二抗(1:50000)室温孵育2h，TBST冲洗6次，5min/次，ECL显影液显影后，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.2.5ELISA检测:①样品处理：细胞收集在EP管中，加入低渗溶液放入液氮3～5s后提出转入-20℃冰箱(20～30s)，再取出室温解冻，重复三次。3000rpm离心10min，取上清检测。②ELISA实验步骤：加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液50μL，余孔分别加标准品或待测样品50μL。酶标板覆膜后37℃孵育30分钟。弃去液体，洗板5次，每次浸泡30S，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶标试剂50μL，加上覆膜，37℃温育30min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔先加显色液A 50μL，再加显色液B 50μL，震荡混匀，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15min左右。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.2.6细胞PpIX的共聚焦显微镜检查:细胞接种到含ALA的35mm培养皿18h(24×104cells/cm2)，细胞用PBS洗涤两次。含或不含ALA(1mM)或甲磺酸伊马替尼(1μM)的DMSO加入完整培养基，细胞在37℃，5%CO295%空气的黑暗环境中孵育4h。3.5h后，细胞用500nM的荧光线粒体探针MitoTracker-Green(分子探针)在37℃条件下染色30min。405和488nm半导体激光光源并发射610～650nm和515～555nm的带通滤波器分别用于PpIX和MitoTracker-Green荧光成像强度。对于每张图像，采用100×油镜Leica SP5显微镜(No11506210，徕卡显微镜系统，德国)观察，1024×1024像素成像格式，每幅图像扫描分辨率为200Hz。

2 结 果

2.1ALA和甲磺酸伊马替尼对ABCG2蛋白表达的影响:Western blot 结果显示，和对照组相比，在HaCaT细胞和HSC-2细胞中，加入ALA(1mM)处理后，细胞中ABCG2的蛋白表达明显降低；在加入ALA(ALA)的基础上进一步加入甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中ABCG2的蛋白表达更加显著的降低(图1)(P<0.01)。用BandScan分析不同处理组中ABCG2蛋白表达的灰度值并进行统计，得出的ABCG2的蛋白相对表达量的统计结果得出相同结论(图2)。

图1 Western bolt结果

2.2ALA和甲磺酸伊马替尼对细胞内原卟啉含量的影响:通过人卟啉ELASA检测试剂盒的检测结果显示，在人类HaCaT角质形成细胞中，加入ALA(1mM)处理后，细胞中总卟啉量明显升高；在加入ALA(ALA)的基础上进一步加入ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中总卟啉量更加显著的升高；与HaCaT角质形成细胞相比，在HSC-2细胞中，加入ALA(1mM)处理后，细胞中总卟啉量明显升高；在加入ALA(ALA)的基础上进一步加入ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼处理后，细胞中总卟啉量更加显著的升高(图3)(P<0.01)。

图2 Western bolt 数据统计

图3 ELASA结果

图4 荧光图

2.3ALA和甲磺酸伊马替尼对卟啉细胞内定位的影响:为进一步探讨ALA和甲磺酸伊马替尼对卟啉物质细胞内定位的影响，采用激光扫描共聚焦显微镜研究ALA诱导的卟啉在细胞内定位。用ALA分别处理HaCaT细胞和HSC-2细胞后，卟啉物质的荧光弥漫分布在所有细胞的胞浆中，尤其表现在HaCaT细胞；而HSC-2细胞内，卟啉物质的荧光集中分布在细胞浆及细胞核(图4)。表明对不同的细胞类型，卟啉物质的分布部位有显著差异。如前所述甲磺酸伊马替尼与ALA共同孵育情况下，同时荧光染色试验结果还显示，HaCaT细胞和HSC-2细胞卟啉物质荧光强度均有不同程度的增加(图4)。

3 讨 论

基底细胞癌是一种最常见的皮肤恶性肿瘤，发病率不断升高[8]。临床多采用液氮冷冻、激光、微波、放疗及手术等治疗方法。近些年随着新型光敏剂的不断问世，为PDT的临床应用提供了更佳的光敏剂，尤其适用于不宜进行传统手术及非手术治疗的患者，具有非手术创伤及良好的美容效果等特点。

本研究通过探讨ALA及甲磺酸伊马替尼对HaCaT细胞和HSC-2细胞内卟啉物质含量的影响以及对ABCG2蛋白表达的影响。在单一ALA作用的情况下，与空白对照组相比，HaCaT细胞和HSC-2细胞中卟啉含量增加；而ALA联合甲磺酸伊马替尼的情况下，较单一使用ALA处理相比，HSC-2细胞中卟啉含量增加更明显。提示ABCG2抑制剂可增强HSC-2对卟啉物质的摄取，而细胞内卟啉物质的含量增加有助于提高PDT的疗效。同时采用免疫印迹法检测细胞ABCG2蛋白的表达，与空白对照组相比，ALA可降低HSC-2细胞中ABCG2蛋白的表达，而ALA联合甲磺酸伊马替尼可显著降低HSC-2细胞中ABCG2蛋白的表达，有关ABCG2蛋白表达的研究结果与Bebes等研究一致[6]。有研究表明PpIX的细胞内定位模式对PDT的疗效有重要影响，尤其对肿瘤细胞死亡的模式[9,10]。研究表明某些靶点对PDT的敏感性强，如在线粒体或溶酶体内蓄积的卟啉物质可加速细胞的凋亡，同时卟啉物质与质膜的结合可加速细胞的坏死，从而导致肿瘤组织的坏死[11,12]。本研究采用激光共聚焦显微镜检查的结果表明，与单一ALA作用于HSC-2细胞相比，ALA联合甲磺酸伊马替尼可显著增强HSC-2细胞内荧光物质的分布及强度，同时ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼可显著影响不同细胞类型的卟啉物质蓄积、分布或聚集状态[5,13]。

总之，本研究表明在HaCaT和HSC-2细胞中，ALA和/或ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼可提高HSC-2细胞内卟啉物质的含量，同时降低细胞内ABCG2蛋白的表达，从而为ABCG2抑制剂甲磺酸伊马替尼联合ALA可提高PDT的疗效提供了理论依据，但对正常的角质形成细胞无此作用，为进一步采用ABCG2抑制剂在PDT治疗基底细胞癌中的应用提供理论基础。