黄芩苷对异丙肾上腺素诱导心力衰竭大鼠心室重构及心室肌凋亡、纤维化的影响

王智 王娟 赵东明

[摘要]目的：探讨黄芩苷对异丙肾上腺素诱导心力衰竭大鼠心室重构及心室肌凋亡、内质网应激、纤维化的影响。方法：将40只清洁级雄性Wistar大鼠分为对照组、黄芩苷低、中、高剂量组及卡托普利组，各8只，共干预28d;多普勒超声检测大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd变化;ELISA法检测血清中NTpro-BNP及ST水平，采用TUNEL及Masson染色检测心室肌细胞凋亡及纤维化情况;Westernblot法检测心室肌组织中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7蛋白表达。结果：与对照组比较，模型组LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高，血清ST2、NT-proBNP水平及心室肌细胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表达升高，Smad7表达降低（P<0.001）;与模型组比较，黄芩苷低、中、高剂量组及卡托普利组心室重构改善，血清T2、NT-proBNP水平及心室肌细胞中AI值、CVF、GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表达降低，Smad7表达升高，且呈剂量依赖性（P<0.001）。结论：黄芩苷可能通过抑制ERS及TGF-β1/Smad7信号通路，起到减少心肌细胞凋亡，抑制心肌纤维化，从而起到逆转心室重构，改善心力衰竭的作用。

[关键词]黄芩苷;心力衰竭;内质网应激;凋亡;纤维化

[中图分类号]R542.23;R363.2

[文献标识码]A

[文章编号]2096-5249（2021）17-0011-02

黄芩在中药归类中，归属清热泻火类药物，但近年来大量研究证实，黄芩中的有效提取物——黄芩苷对多种原因造成的心肌细胞损伤有明确效果[1-2]。异丙肾上腺素（ISO）是制备心力衰竭大鼠模型的经典药物，通过激动β受体，促使心率加快，使心脏长期处于相对缺血环境，最终引发心力衰竭[3]。内质网应激（ERS）本为真核细胞的一种自我保护机制，可降解内质网中错误折叠蛋白，而长期或强度过高的内质网应激使细胞自身难以将错误折叠蛋白全部降解，最终导致细胞凋亡，而抑制ERS，减少心肌细胞凋亡数量也是目前心力衰竭的研究热点和新方向[4]。本研究通过ISO建立心力衰竭大鼠模型，应用不同剂量黄芩苷进行干预，观察心力衰竭大鼠心室重构、心肌细胞凋亡、ERS及纤维化发生情况。

1材料与方法

1.1实验药品及试剂黄芩苷（江北药业，纯度≥98%）;TUNEL试剂盒（翊圣生物科技有限公司）;ST2、BNP试剂盒（北京六一公司）;GRP78、IRE1、CHOP、山羊抗兔二抗单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。5180/R型离心机（德国Eppendorf公司）;WD-9413B型凝胶成像系统（北京六一公司）;ChemDocXRS型化学发光成像仪（美国Bio-red公司）。MK3型酶标仪（美国Multiskan公司）;GEVividE9彩色超声（美国GE公司）。

1.2心力衰竭模型大鼠制备与分组40只清洁级雄性Wistar大鼠，体重（200±15）g，随机分为对照组、模型组、黄芩苷低、中、高剂量组卡托普利组，每组各8只。对照组外，其余大鼠均根据文献[5]制备心力衰竭模。黄芩苷组低、中、高剂量组分别给予黄芩苷25、50、100mg/kg·d灌胃，卡托普利组给予卡托普利50mg/kg·d灌胃[6]，对照组每天给予等体积生理盐水灌胃，每组均连续给药28d。

1.3多普勒心脏超声检测于实验第28d将大鼠麻醉，脱毛膏退去胸前毛发，应用皮肤探头对大鼠进行心功能检测，记录并比较各组大鼠LVEF%、LVPWd及LVEDd情况。

1.4血清ST2、NT-proBNP水平检测各组大鼠进行腹主动脉抽血，并处死，2000r/min条件下分离血清，采用ELISA法对ST2、NT-proBNP进行检测，严照说明书操作。

1.5TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况处死大鼠后使用眼科剪子取心室部分组织，经脱水、固定、TUNEL染色后放入恒温箱进行孵育，冲洗3次后进行封片。应用光学显微镜观察镜下凋亡细胞，褐色代表已凋亡细胞，蓝色代表仍生存细胞，于200倍镜下观察各组大鼠心室肌细胞凋亡情况，凋亡指数（AI）=各视野阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%，实验独立重复3次。

1.6Masson染色将各组大鼠心室肌组织投入至固定液中，经脱水、固定后，置于切片机中连续切片，经脱蜡、二甲苯透明后进行Masson染色。染色后用ImageJ5.0图像分析软件镜下组织胶原容积分数（CVF）分析进行统计，实验独立重复3次。

1.7Westernblot法检测ERS及纤维化信号通路蛋白将大鼠部分心室加入液氮，冷研磨后制备10%组织匀浆，根据文献[7]进行操作，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1、Smad7单克隆抗体比例分别为1：800、1：1000、1：800、1：1000、1：1000，后经暗室曝光，扫描胶片，用凝胶图象处理系统分析，实验独立重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS20.0软件，计量资料以x±s表示，多组间比较数据采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1多普勒超声结果超声结果显示，模型组较对照组LVEF%、LVPWd降低，LVIDd升高（t=-11.16，t=-12.76，t=24.58，均P<0.001）;黄芩苷低、中、高劑量组及卡托普利组较模型组LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低;且随黄芩苷剂量升高上述指标改善趋势更加明显（P<0.001），详见表1。

2.2血清ST2、NT-proBNP检测结果结果显示，模型组较对照组ST2、NT-proBNP水平升高（t=8.8，t=21.3，P<0.001）;黄芩苷低、中、高剂量组及卡托普利组较模型组ST2、NT-proBNP水平降低，且随黄芩苷剂量升高而降低（P<0.001），详见表2。

2.3TUNEL染色结果结果显示，模型组（8.49±3.97）较对照组（3.66±0.19）AI值升高（P<0.001）;黄芩苷低（29.87±5.69）、中（25.4±2.66）、高剂量组（15.13±1.55）及卡托普利组（15.47±0.76）较模型组AI值降低，且随黄芩苷剂量升高而降低（F=94.36，P<0.001）。

2.4Masson染色结果结果显示，模型组（26.47±1.82）较对照组（2.37±0.49）CVF升高（t=22.15，P<0.001）;黄芩苷低（18.57±1.93）、中（12.37±1.43）、高剂量组（7.23±0.91）及卡托普利组（7.2±0.85）较模型组CVF降低，且随剂量的升高而降低（F=74.66，P<0.001）。

2.5ERS信号通路蛋白检测结果结果显示，模型组大鼠心室肌组织中GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表达较对照组升高，Smad7较对照组降低（t=6.19，t=14.82，t=24.98，t=17.44，t=-15.14，均P<0.001）;黄芩苷低、中、高剂量组及卡托普利组较模型组GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表达降低，Smad7表达升高;且随黄芩苷剂量升高改变趋势越加明显（P<0.001），详见图1、表3。

3讨论

心肌纤维化和心肌细胞凋亡是导致心室重构的重要原因，而心室重构又是心力衰竭的病理基础，因此，抑制心肌细胞凋亡及纤维化是逆转心室重构，改善心力衰竭的新方向[8-9]。黄芩苷对不同心血管疾病的作用已在心血管领域成为研究热门，有潜质成为治疗或辅助治疗多种心血管疾病的有效药物[10]。

本团队在前期研究中证实[2]，黄芩苷可通过抑制线粒体凋亡信号通路，降低脓毒血症损伤心肌细胞的凋亡数量。黄芩苷对于ISO誘发心力衰竭心肌保护作用鲜有报道，本团队通过，颈部后皮下注射ISO进行心力衰竭模型大鼠造模，进而采用不同浓度黄芩苷进行干预，并使用卡托普利作为阳性对照药物，观察黄芩苷对心力衰竭大鼠心室重构、心肌细胞凋亡、纤维化的作用。结果发现，经不同浓度黄芩苷干预治疗后，大鼠LVEF%、LVPWd升高，LVIDd降低，且血清中心衰标物ST2、NTpro-BNP均降低，且随剂量增高改善趋势愈加明显，从形态学与血清标记物角度说明心力衰竭模型大鼠心室重构在一定程度上被逆转，心力衰竭有所改善，存在剂量依赖性。TUNEL及Masson染色实验结果证实，心力衰竭模型大鼠

心室肌组织存在较为严重的纤维化和细胞凋亡，而经黄芩苷干预治疗后，心室肌组织AI值及CVF均降低，且随剂量的增加而降低，说明黄芩苷逆转心室重构可能是通过抑制心肌细胞凋亡和抑制纤维化实现的。

目前，研究已证实持续而强烈的ERS是引起的ISO心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的重要因素[11]。TGF-β1是目前已知的能导致大部分器官发生纤维化的细胞因子，其可能通过过表达Smads相关蛋白加重组织或器官纤维化，而Smads7是Smads家族蛋白的抑制受体，当Smads7低表达时，则可能导致纤维化的发生[12]。为了探究黄芩苷抑制心肌细胞凋亡和纤维化的深层机制，本团队对心室肌组织ERS和TGF-β1/Smads7纤维化信号通过进行检测。结果证实，心力衰竭大鼠心室肌组织GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1呈高表达，Smad7呈低表达，说明心力衰竭大鼠心室肌组织存在ERS引起的凋亡和TGF-β1/Smads7引起的纤维化。而经黄芩苷干预治疗后，GRP78、IRE1、CHOP、TGF-β1表达降低，Smad7表达升高，且黄芩苷剂量升高改变趋势越加明显，说明黄芩苷可能通过阻断ERS和TGF-β1/Smads7信号通路，起到抑制心室肌细胞凋亡及纤维化作用，进而逆转心室重构，改善心力衰竭的作用。

综上所述，黄芩苷可能通过抑制GRP78/IRE1/CHOP及TGF-β1/Smad7信号通路，起到减少心肌细胞ERS凋亡，抑制心肌纤维化，从而起到逆转心室重构，改善心力衰竭的作用。

参考文献

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基金项目：吉林省中医药科技普通资助项目（编号：2019126）

*通信作者：王智（1983-），男，硕士，主治医师，研究方向：冠心病发病机制及药物治疗研究。

（收稿日期：2021-3-11 接受日期：2021-4-27）