玉米农杆菌转化方法

司 冰

（河南省种子管理站，河南 郑州 450046）

玉米作为世界上主要的粮食作物和工业原料之一，推动其转基因技术研究与应用，是进行玉米功能基因组研究的有效方法，同时对确保国家粮食安全有重要意义。当前全球商业化的转基因植物有107 种，其中，作为主流方法的农杆菌转化和基因枪转化分别占到了64%和31%，而利用DNA 直接转移法和电激法的仅有5%[1]。农杆菌介导法在玉米遗传转化方面占有很大的优势，单拷贝数、基因沉默比较少、性价比高等。

1 根癌农杆菌

根癌农杆菌是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，是一种天然的基因转化系统。它以双子叶植物为天然宿主，双子叶植物中的遗传转化已经取得了非常好的进展，但是对于玉米这样的单子叶植物来说，遗传转化就没有那么容易了，其遗传转化研究相对双子叶植物落后。

根癌农杆菌携带有Ti 质粒，可以诱发植物产生冠瘿瘤，而T-DNA 是根癌农杆菌Ti 质粒上的一段DNA序列,可以转移并稳定整合到植物核基因组中。外源基因就是整合到T-DNA 上，通过T-DNA 的转移整合到植物基因组中。Ti 质粒因为上述优点成为了导入外源基因的有效载体。农杆菌介导的遗传转化方面的研究已经日臻完善，发展成了植物基因工程中不可缺少的工具。因此，农杆菌被称为自然界中的“天然遗传工程师”[2]。目前，在玉米遗传转化中使用的农杆菌有3 种类型，不同的类型毒性不同，应根据受体的不同选择不同的菌株，产生不同的转化效率。这3 种类型分别是章鱼碱型（以LBA4404 为代表）、胭脂碱型（以C58 菌株为代表）、琥珀碱型（以EHA101 和EHA105为代表）。

2 玉米农杆菌转化的受体

2.1 以幼胚为受体

以前的研究多以胚性愈伤组织为受体材料，但是胚性愈伤组织只有极少数材料能稳定高效诱导出来，其诱导和分化受品种基因型的限制，加上胚性愈伤组织培养条件摸索，周期比较长，无菌操作繁琐细致等原因，严重制约了玉米转基因的研究进展，因此，玉米幼胚是较有效的转化受体。

2.2 以愈伤组织为受体

在进行遗传改良的过程中，通过组织培养获得高频率的胚性愈伤组织是转化进行的前提条件，尤其是利用未成熟的幼胚诱导的愈伤组织。以前的学者将玉米的愈伤组织主要分为2 种类型：Ⅰ型：黄白色、整体结实、较硬、不易分开、生长慢、易发生器官的分化；Ⅱ型：乳黄色、蓬松、粒状、生长较快、易产生胚状体。Ⅱ型是目前玉米转化的常用受体，具有较高的转化频率和再生频率。但是很多自交系不易形成Ⅱ型愈伤组织，利用Ⅰ型愈伤组织进行农杆菌转化是目前要克服的关键问题。

2.3 其他组织为受体

幼胚的供应受到季节的限制，不利于常年转基因的进行；愈伤组织诱导操作的繁琐也限制转基因的发展。因此，有研究人员开始开发新的转化受体，比如茎尖分生组织、成熟胚及茎尖分生组织诱导的胚性愈伤组织等。

3 影响农杆菌转化效率的因素

3.1 农杆菌的选择

农杆菌是进行遗传转化的有效工具，农杆菌的选择在很大程度上决定着遗传转化效率的高低。选择合适的农杆菌进行转化是进行转基因的前提。

3.2 培养基种类的选择

目前，农杆菌侵染玉米的基本培养基主要是N6和MS 2 种，不同的自交系选择不同的培养基，对每个培养基进行微调可以有效地改善转化效率。

3.3 受体类型及来源

玉米遗传转化成功的一个关键因素就是受体材料，不同基因型、不同发育时期的玉米幼胚及愈伤组织对农杆菌侵染的感受性存在着差别，它的感受态直接关系着转化成功与否。转化受体一般要选择生命力旺盛、易于分化、易于成苗的材料。不同的玉米品种其幼胚生长能力不同，分化愈伤的能力不同，有的玉米品种都不能诱导出愈伤组织。

3.4 共培养条件

侵染效率的高低很大程度上与共培养有关系，共培养培养基的选择、培养时间的长短、培养温度的高低都能影响侵染效率。酚类物质与农杆菌Vir 基因活化诱导有关，其中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮作用较强，在共培养的过程中加入乙酰丁香酮可以有效地提高转化效率。

4 展望

世界范围内转基因作物已经扩展到四大作物（玉米、大豆、棉花和油菜）之外，为全球消费者和食品生产商提供了更多选择，这些转基因作物均已上市销售，包括紫花苜蓿、甜菜、木瓜、南瓜、茄子、马铃薯和苹果。而我国早在2009 年就给转植酸酶基因玉米品种及抗虫水稻品种颁发了安全证书，2019 年又拟批准为192 个植物品种目录颁发农业转基因生物安全证书，其中包括2 种转基因玉米，即大北农生物技术有限公司的 DBN9936 和杭州瑞丰生物科技有限公司与浙江大学的双抗12-5。转基因技术作为一项应用型技术，在我国农业领域取得一定技术突破，将给种业龙头企业、种业股传递利好信息。但是目前对于很多优良自交系来说，利用农杆菌进行遗传转化还是比较困难的，尤其是一些当前育种中使用的常规自交系。而且我国现在有很多特用玉米品种，对这些特用玉米品种进行遗传改造还有一段路程要走，需要克服这些困难找到适合这些玉米品种的方法来进行遗传修饰。