循环肿瘤细胞检测在乳腺癌临床应用中的研究进展

孙鸿妍，杨 梅，张晓天，任浩文，刘秀敏，朱洪权

(吉林大学第二医院 检验科，吉林 长春130041)

乳腺癌是一种临床上较为常见的妇科恶性肿瘤，严重威胁着我国女性生命健康[1]。在乳腺癌患者中，有很多患者由于病灶转移至其他脏器而引发死亡。据资料显示，乳腺癌转移十分迅速，在早期检查时就发生转移者可达10%，而仅有20%的患者在确诊乳腺癌后可生存5年以上[2]。因此，危及乳腺癌患者生命的关键在于乳腺癌的复发和转移。对于以往乳腺癌的诊断，常采用影像学方法来检查乳腺癌原发病灶。然而，该方法只有病灶肿物直径大于5 mm时才可被捕捉到，故无法及时发现肿瘤是否转移[3]。因此，对于乳腺癌转移和诊断的研究，寻找一种可尽早发现病灶转移情况的检测指标成为了现今研究的热点。而通过液体活检所得到的循环肿瘤细胞，其操作微创性及可实时监测性等优点可实现乳腺癌的早期诊断和监测转移[4]。

1 CTC的生物学特性

CTC是指来源于原发瘤体，在某些理化因素作用下不受血流切割力及机体免疫效应等影响脱离基底膜而进入血液的肿瘤细胞[5]。由于来自原发瘤体，其与原发肿瘤细胞性质相同，因此可通过对CTC的检测来判断肿瘤的转移情况。肿瘤细胞脱离基底膜后进入血液，在血流切割损伤、免疫杀伤以及细胞凋亡等作用下，最终在外周血所有细胞中，有活性的CTC仅占<0.01%，称为高转移潜能CTC[6]。更有研究表明，CTC在外周血中含量甚微，检测106-107个白细胞才能捕捉到一个CTC。这表明CTC数量具有稀有性[7]。同时，CTC具有较强的异质性。为了加速肿瘤的转移进程，部分CTC会有上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生，即上皮细胞表型转化为间质细胞表型，导致上皮细胞形态发生改变[8-9]。不同肿瘤以及不同TNM分期的肿瘤其细胞表型会有所不同，因此，检测肿瘤患者的CTC在癌症的精确诊断中发挥了重要作用。

2 CTC的转移机制

从原发病灶脱落的肿瘤细胞躲避了多种杀伤因素而存活下来，进一步浸润血管内皮进入血液或淋巴系统并参与循环，植入靶器官并增殖，从而实现肿瘤的转移[10]。这就是肿瘤转移过程中的“种子-土壤”学说。Giovanni Zarrilli等[11]认为，种子是由肿瘤细胞、其他细胞和基质组成的复合物。其中的内皮细胞受肿瘤细胞刺激后产生新的细小血管为肿瘤增殖提供能量及动力；巨噬细胞产生可溶解因子以促进其生长及迁移。土壤则是靶器官的基底膜，为肿瘤细胞的增殖提供合适的环境。同时，上皮-间质转化通过促进CTC的生成及迁移，在肿瘤转移过程中起到重要作用。CTC发生EMT时上皮连接蛋白表达减少，间质黏附蛋白表达增加，上皮细胞转变为梭形的间质细胞，在细胞形态学上有利于肿瘤细胞的迁移[12]。EMT可提高CTC在外周血中的存活能力，增加了CTC的移行性，进而增加了CTC的侵袭性[13]。CTC不断生成及迁移，进而侵袭组织，完成了肿瘤的转移过程。

3 CTC检测在乳腺癌诊断及治疗中的应用

3.1 乳腺癌的早期筛查及诊断

由于液体活检的创伤较小、操作简单、样本较容易获取，且CTC的检测仅需采集受检者的外周血，故可通过CTC检测来对乳腺癌进行早期筛查。Cristofanilli等[14]认为，通过检测外周血中是否存在CTC以及在一段时间后CTC数是否有增加趋势，可以较早筛查出乳腺癌患者，早期即可采用适宜的方案进行治疗。Kallergi G等[15]对25例转移性乳腺癌患者CTC中间质标志物Vimentin及Twist 1进行检测，结果显示均为阳性，故可利用CTC对转移性乳腺癌进行诊断。Lang JE等[16]认为，目前，我们通过检测CTC的RNA序列，来对乳腺癌进行诊断是可行的。该方法通过对乳腺癌患者的CTC进行全转录组分析，并与乳腺癌肿瘤细胞进行比对，从而实现乳腺癌类型的诊断。Gradilone A等[17]对92例乳腺癌患者的CTC进行检测，其中有91%的Ⅳ期患者CTC具有ALDH1(+)，波形蛋白(+)，纤维蛋白(+)的特征。并且，ALDH1(+)与疾病分期显著相关。因此，CTC可对不同分期的乳腺癌患者进行诊断。对于乳腺癌的诊断，由于免疫杀伤等作用的影响，CTC在血液中含量过少，因此，仍需以组织活检及影像学检查为基础，将CTC检测作为辅助检查手段，更早地发现乳腺癌的存在。

3.2 预测乳腺癌的转移情况

肿瘤细胞从原发病灶脱落进入到外周血中形成CTC，具有与原发肿瘤相似的生物学特性，故可通过对血液中CTC的检测来反映乳腺癌原发病灶的状态。因此，CTC可作为乳腺癌患者转移的早期预警。CTC对转移灶数目的预测能力与CTC的数量成正比[18]。CTC的检测可用于评估转移性乳腺癌的转移灶数目。据文献显示，Ning Xie等[19]选取了38例转移性乳腺癌患者，同时在健康女性中随机抽取25位作为对照组，通过免疫荧光法检测CTC。结果表明，有73.3%的患者血液中至少含有1个CTC，而对照组无CTC检出。按转移部位数量分为三组，1个、2个及3个以上的CTC阳性率分别为33%、50%及95.45%。且患者CTC阳性率越高，患者的总生存率(OS)越短。经多变量分析可知，患者OS与CTC及转移灶数目，呈显著相关。此外，CTC检测是转移性乳腺癌患者有效的预后工具。Huebner等[20]进行了一项CTC检测与其预测转移性乳腺癌预后能力的研究。在该研究中，血液中≥1个CTC的患者的OS低于未检测出CTC的患者。且当患者出现每7.5 ml血液中≥5个CTC时，患者的无进展生存时间(PFS)和OS均出现显著缩短。由此可见，CTC是转移性乳腺癌患者预后的关键预测因子。因此,利用液体活检的方式对外周血中的CTC进行检测，可实现对乳腺癌患者转移情况的动态监测。

3.3 动态监测乳腺癌进展及选择治疗方案

在已确诊的乳腺癌患者中，对其外周血中CTC进行检测，来判断原发病灶的异质性，通过异质性来动态监测癌症进展情况。Vasseur A等[21]在一项研究中发现，选取254名乳腺癌患者利用AdnaTest和CellSearch系统进行CTC检测。得到的结果分别为：有42%的HER2+患者中只含有HER2-的CTC，有33%的HER2-患者中含有HER2+的CTC。这反映了乳腺癌在疾病发展过程中出现了异质性，肿瘤的耐药性也会随之增加。随时对患者的CTC进行检测，通过CTC阳性率的变化，可尽早发现对一线治疗产生耐药性的情况。这一变化，可指导医生尽早改变治疗药物，在恶化、转移之前进行干预。这种方法发现病人耐药性可早于临床表现或影像学约2个月[22]。此外，通过CTC的计数，可以用来选择乳腺癌患者适宜的治疗方案。通过STIC-CTC试验可以发现，当CTC<5个/7.5 ml时，采用内分泌治疗，当CTC≥5个/7.5 ml时，进行化学治疗的治疗方案，使乳腺癌患者的PFS得以显著升高[23]。因此，分析外周血中的CTC可判断肿瘤的发展情况，并有助于进行更有效的治疗选择。

3.4 判断药物的治疗疗效

通过CTC的检测，可为患者确定最有效的治疗方法。治疗过程中，根据患者CTC的变化情况可判断患者的预后，从而判断治疗药物疗效。Magbanua MJM等[24]最近的一项研究表明，采用治疗前后CTC变化趋势曲线与单纯CTC计数相比可以更全面地判断药物疗效，也能更好地预测乳腺癌患者的OS及PFS。通过对CTC的检测，可以判断肿瘤存在的异质性，这可为HER2-乳腺癌但HER2+的CTC患者使用抗HER2药物疗效不足提供依据，从而及时寻找新的治疗药物[25]。目前有研究表明，利用CTC计数可知，外周血中CTC<5个/7.5 ml的患者早先采取新疗法要比CTC≥5个/7.5 ml的患者疗效好[26]。因此，CTC的检测对于判断治疗乳腺癌药物的疗效，具有一定的帮助。

3.5 发现新的治疗靶点

由于外周血的采集较为方便，因此，可随时、多次对外周血中CTC进行检测，这种液体活检技术可使医生随时掌握乳腺癌患者的病情变化。由于肿瘤具有异质性，通过液体活检可检测到在转移过程中肿瘤细胞可能发生的生化变化，而这在原发肿瘤中是不存在的，有助于寻找适宜的、有针对性的治疗靶点[27]。此外，不同患者的CTC表型存在差异，对CTC的分子表型进行分析可以发现相应的治疗靶点，从而指导临床上更好地进行个体化治疗，有助于进入“精准医疗时代”[28]。可对乳腺癌患者的CTC进行RT-PCR检测，判断肿瘤细胞基因是否发生突变。若发生突变可能表明耐药性增强，提示需要寻找新的治疗靶点[29]。但该方法局限于CTC计数较高的患者。就目前CTC的生物学分选方法来说，捕获CTC的标志物常采用上皮细胞粘附分子(EpCAM)。但由于EpCAM在发生EMT的过程中可能发生下调，因此，目前需寻找更多的间质标志物来捕获CTC，完成对CTC的富集[30]。根据对CTC的检测，可以判断肿瘤细胞mRNA及蛋白质的表达情况，而许多蛋白质是抗肿瘤药物的实际靶点，这对确定乳腺癌的治疗十分有利[31]。

4 小结

CTC检测作为乳腺癌检查的辅助手段，由于其可实时监测乳腺癌的进展、识别肿瘤异质性且创伤小等优点，已经成为了一项临床感兴趣的液体活检技术。CTC可在体外进行培养，目前，研究人员已成功建立乳腺癌患者的CTC细胞系及CTC异种移植物，可将二者用于体内及体外药敏试验，从而判断肿瘤细胞耐药性及增加新的治疗靶点。目前来看，部分实验对CTC数量具有一定的要求，但CTC检测的灵敏度及特异性较低，低检出率往往限制了CTC检测的临床应用，未来应寻找新的分离及检测技术，更好地将CTC应用于临床。目前新兴的液体活检技术，也包括ctDNA的检测。ctDNA可提供肿瘤的基因组信息，其比CTC更易分离，且具有较高的特异性及灵敏度。但有些信息是无法从ctDNA中获得的，例如CTC可提供从蛋白质和RNA中获得的信息。故在组织活检及影像学基础上，可将CTC与ctDNA结合，对乳腺癌患者进行更加全面，多方位检测。发挥液体活检技术更大的潜力，使患者及时得以更有针对性的治疗。