外泌体来源的环状RNA在肿瘤诊疗中的价值

杨文静， 吕丽华， 姚嘉怡， 王 皓， 张春燕， 王蓓丽， 潘柏申， 郭 玮

（1.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建 厦门 361015）

外泌体是由多种细胞分泌的、粒径为30～150 nm的小膜泡，存在于血液、尿液、脑脊液、唾液和乳汁等体液中。外泌体内容物广泛，包括蛋白质、脂质和核酸[DNA、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）等][1]。circRNA是一类以共价封闭环为特征，无5'和3'末端头尾结构，广泛存在于真核细胞中的特殊RNA分子，与多种人类疾病的发病机制相关[2]。LI等[3]的研究结果显示，血浆外泌体中稳定存在大量circRNA。本文对外泌体来源的circRNA在肿瘤中的生物学功能，及其作为肿瘤早期诊断和预后评估标志物的潜在应用作一综述。

1 外泌体及其生物学功能

外泌体最早于1983年在绵羊网织红细胞中被发现，1989年由Johnstone命名。外泌体的形成是一个连续性的过程，主要包括内吞、融合和外排，即膜内陷形成动态亚细胞结构的多囊体，多囊体有2种结局：（1）与溶酶体融合，其内的管腔状囊泡发生降解；（2）与细胞膜融合，其内的管腔状囊泡再次凹陷，以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并被释放入细胞外环境，即外泌体[4]。

外泌体的主要功能是在生理和病理条件下通过其内容物介导细胞间通信。另外，外泌体在凝血、抗原提呈、免疫调节和病毒复制等方面也发挥了一定作用。外泌体内容物，如蛋白质、mRNA、miRNA等被证实可在受体细胞中起作用，从而激活多种信号通路[5]。肿瘤细胞可比正常细胞分泌更多的外泌体，且内容物有一定差异，肿瘤细胞来源的外泌体可为肿瘤的发展提供合适的微环境，如细胞增殖、血管生成和转移、耐药及转移前微环境的形成[6]。

2 circRNA及其生物学功能

circRNA和线性RNA都起源于前体mRNA，但是与经典剪接产生的线性RNA相反，circRNA通常是通过反向剪接形成的。circRNA源自基因组的所有区域，包括基因间、内含子、反义和非翻译区。根据其来源，circRNA可分为三大类：外显子circRNA、外显子-内含子circRNA和环状内含子RNA。由于circRNA具有共价闭环的特殊化学结构，因此不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定[2]。

circRNA起初被认为是由剪接错误而产生的无功能的副产物。随着高通量测序技术和生物信息学研究的发展，在哺乳动物细胞中发现大量circRNA，充分表明其具有结构稳定、高度保守、表达量丰富的特征[7]。circRNA的主要生物学功能包括：（1）竞争性结合miRNA，调控靶基因表达；（2）与RNA结合蛋白相互作用，调控基因表达；（3）调节基因转录或剪接；（4）翻译蛋白质；（5）调节表观遗传。有研究结果显示，circRNA与多种人类疾病的发病机制相关，包括神经系统疾病、心血管疾病、类风湿性关节炎和糖尿病等。circRNA在肿瘤生长、转移、干性和治疗抗性中起关键作用，可作为癌症诊断和预后的生物标志物[8]。

3 外泌体circRNA在肿瘤中的生物学功能

外泌体参与了肿瘤转移前微环境和肿瘤微环境的形成。另外，通过介导免疫抑制和免疫监视，外泌体与肿瘤复发和肿瘤细胞的存活相关[9]。LI等[3]发现多种癌细胞系（结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌）衍生的外泌体中稳定存在着大量circRNA，并可在患者血清、尿液和肿瘤组织中被检测到。已有大量研究证实circRNA可能与恶性肿瘤的发生、发展有关，可调控细胞增殖、肿瘤转移以及化疗药物耐药，见表1。

3.1 调控肿瘤细胞增殖

增殖失调是肿瘤转化中重要的因素之一，因此细胞周期的调控机制日益受到关注。近年来，越来越多的外泌体circRNA在各类癌症中调控肿瘤细胞增殖的作用被揭示。如：外泌体来源的circRASSF2可促进喉鳞状细胞癌的进展，与对照组相比，在肿瘤组织中circRASSF2的表达显著且持续增加，下调外泌体circRASSF2通过miRNA-302b-3p/IGF-1R轴可显著抑制细胞增殖[10]。

长期暴露于亚砷酸盐会诱导人肝上皮细胞（L-02）发生恶性转化，并引起circ_100284过度表达，circ_100284可能会通过外泌体从转化的L-02细胞转移到正常细胞中。在正常细胞中，外泌体circ_100284通过与miRNA-217相互作用，加速了细胞周期并促进细胞增殖。这表明外泌体circRNA在细胞间的通信中起信使的作用，并提示了亚砷酸盐诱导的致癌机制[32]。外泌体circDB在高体脂率的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中上调，脂肪细胞分泌的外泌体circDB可通过抑制miRNA-34a并激活USP7/Cyclin A2信号通路，调节HCC中的去泛素化，从而促进细胞生长并减少DNA损伤[11]。

在结直肠癌中，circIFT80通过进入外泌体促进结直肠癌的发展，通过miRNA-1236-3p/HOXB7轴，促进DNA合成和抑制细胞凋亡[12]。结直肠癌患者血清外泌体中circFMN2呈高表达并与miRNA-1182水平呈负相关，circFMN2与miRNA-1182结合可显著促进结直肠癌细胞增殖，这提示外泌体circFMN2在促进结直肠癌肿瘤生长中起重要作用[13]。

此外，外泌体来源的circNRIP1作为miRNA-149-5p的海绵，可影响AKT1/mTOR信号通路，并促进胃癌细胞增殖[14]；外泌体来源的circ_0044516作为miRNA-29a-3p海绵，可促进前 列腺癌细胞增殖[15]。

表1 外泌体来源的circRNA在肿瘤中的生物学功能

3.2 调控肿瘤侵袭和转移

外泌体可介导原发性肿瘤部位和远处转移部位之间的分子通讯及物质转移，通过调节包括上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在内的一系列细胞活动，外泌体在肿瘤细胞的转移和侵袭中起重要作用[33]。

WANG等[16]发现外泌体circPTGR1有助于HCC的转移，circPTGR1的高表达与临床分期和预后有关，敲除外泌体circPTGR1的表达显著抑制了肿瘤在非转移和低转移细胞系中的侵袭和转移。外泌体circPTGR1还可与MET相互作用，靶向竞争miRNA449a，从而导致肿瘤微环境失调，并促进HCC的发展。外泌体circ_100338参与了HCC中血管生成和转移的调控，与HCC的进展密切相关[17]。此外，过表达circCdr1as的HCC细胞可通过外泌体的传递加速周围正常细胞的增殖和转移能力[18]。

外泌体circRNA与胃癌的相关研究结果显示，circNRIP1可通过外泌体在胃癌细胞之间传递，并作为miRNA-149-5p海绵影响Akt1/mTOR信号通路，从而促进胃癌细胞转移[14]。circRanGAP1在胃癌患者癌组织和血浆外泌体中均显著上调，该分子通过miRNA-877-3p/VEGFA轴可增强胃癌细胞的转移和侵袭能力[19]。最新的研究结果[20]显示，来自胃癌细胞的外泌体将ciRS-133传递到前脂肪细胞中，通过激活PRDM16和抑制miRNA-133来促进前脂肪细胞向褐色样细胞分化；进一步敲低ciRS-133可使小鼠的癌症恶病质明显减少，提示外泌体传递的ciRS-133参与了白色脂肪组织褐变并在癌症相关恶病质中起关键作用。

某些外泌体circRNA的表达在胰腺癌的进展和转移中起重要作用。LI等[21]发现外泌体circPED8A在胰腺癌组织中呈高表达，且与淋巴管浸润、TNM分期和低生存率有关，circPDE8A可通过上调MET（上皮性肿瘤的关键癌基因之一）来促进肿瘤细胞的生长。此外，肿瘤细胞分泌的circPDE8A可通过外泌体被释放到血液循环中，作为miRNA-338海绵调节MACC1，并通过MET/丝裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）或蛋白激酶B途径促进侵袭性转移。此外，还有学者[22]发现由胰腺癌细胞分泌的外泌体中的circIARS在胰腺癌组织中广泛表达，其表达水平与肝转移、血管侵犯和TNM分期呈正相关（肝转移：P=0.011；血管侵犯：P=0.020；TNM：P=0.023）。CircIARS可通过衍生自胰腺癌细胞的外泌体进入人微血管静脉内皮细胞，下调miRNA-122和紧密连接蛋白-1（zonula occludens 1，ZO-1）的水平，上调RhoA和RhoA-GTP的水平，增加F-肌动蛋白的表达和黏着斑，使内皮单层通透性增加，促进肿瘤的侵袭和转移。

CHEN等[23]分离了膀胱尿路上皮癌患者血清和尿液中的外泌体，结果显示，这些外泌体中的circPRMT5均显著上调，circPRMT5可充当miRNA-30c海绵，通过circPRMT5/miRNA-30c/SNAIL1/E-钙黏蛋白1途径促进EMT。有研究结果显示，血清和尿液外泌体中高表达的circPRMT5与淋巴结转移和晚期肿瘤进展呈正相关（P＜0.05）。在卵巢癌中，外泌体通过转移circPUM1和circWHSC1，作用于腹膜间皮细胞，从而促进肿瘤转移[24-25]。除此之外，结直肠癌[12，26]、胆管癌[27]相关研究也发现了外泌体circRNA促进肿瘤侵袭和转移的作用。

3.3 调控肿瘤化疗耐药

对化疗药物耐药是肿瘤治疗的巨大障碍。有研究结果显示，外泌体可在癌细胞之间传递耐药性[34]，其内容物circRNA在化疗耐药传递中的重要作用也逐渐被揭示。LI等[28]的研究结果显示，与对照组相比，小细胞肺癌组血清外泌体FLI1外显子circRNA（FECR1）异常上调，且与患者低生存率相关。circCdr1as参与了卵巢癌顺铂耐药的形成，作为miRNA海绵下调miRNA-1270，而SCAI是miRNA-1270的靶基因，可增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。顺铂耐药组的血清外泌体circCdr1as与顺铂敏感组相比异常下调，且circCdr1as的表达水平与miRNA-1270的表达水平呈显著负相关（r=-0.679，P=0.000）[29]。由此可见，外泌体circRNA失调与化疗药物耐药之间可能存在一定的联系。

外泌体circRNA在调节化疗药物耐药中发挥着重要作用。circ_0000338是来自FCHSD2基因的circRNA，该基因参与编码内吞作用和膜受体内在化的蛋白质。circ_0000338通过耐奥沙利铂HCT116细胞系（HCT116-R）分泌的外泌体选择性转移到共培养的亲本HCT116细胞系（HCT116-P）后，与对照细胞相比，HCT116-P细胞在药物治疗中的生存力显著提高[30]。外泌体中circ_0000338上调可作为早期预测结直肠癌化疗药物耐药性的潜在生物标志物[30]。

恶性肿瘤通常依靠有氧糖酵解来产生三磷酸腺苷，以实现快速生长和化疗药物的耐药性。M2-PK在催化糖酵解中起关键作用。有研究结果显示，M2-PK在结直肠癌细胞中的表达有异质性，即在耐奥沙利铂的结直肠癌细胞中较高，在奥沙利铂敏感的细胞中相对较低。miRNA-122与化学抗性呈正相关，耐奥沙利铂细胞的外泌体将ciRS-122传递至敏感细胞，通过吸附miRNA-122和上调M2-PK来促进糖酵解和耐药性，这种细胞间的信号传递可提示潜在的新型治疗靶点，并为外泌体在耐药性结直肠癌中的临床应用奠定了基础[31]。

4 外泌体circRNA在肿瘤诊断及预后评估中的价值

circRNA在外泌体中富集并具有良好的稳定性，可从人血清、尿液等体液中检测到。肿瘤患者体内外泌体circRNA的表达谱与健康人群有一定区别[9]。因此，外泌体circRNA具有极大的潜力作为某些肿瘤非侵入性早期诊断和预后评估的分子标志物。

与含有野生型和G13D突变体KRAS等位基因细胞系（DLD-1）和K-ras突变型结直肠癌细胞（DKO-1）相比，K-ras野生型结直肠癌细胞DKs-8中外泌体circRNA水平显著上调，提示外泌体circRNA或可作为结直肠癌的生物标志物[35]。有研究结果显示，与对照组相比，不同TNM分期的结直肠癌患者血清外泌体circ_0004771均显著上调（P=0.017），circ_0004771诊断结直肠癌的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.88，敏感性为80.91%，特异性为82.86%；Ⅰ～Ⅱ期结直肠癌患者血清外泌体circ_0004771显著高于正常对照组（P＜0.001），且诊断Ⅰ～Ⅱ期结直肠癌的AUC为0.86，敏感性为81.43%，特异性为80.00%[36]。BARBAGALLO等[37]发现，结直肠癌患者血清外泌体circHIPK3显著上调，诊断结直肠癌的AUC为0.771，敏感性为71%，特异性为80%。SHAO等[38]发现，早期胃癌（early gastric cancer，EGC）患者血浆外泌体circ_0065149显著低于健康对照者（P＜0.001），筛查EGC的AUC为0.64，敏感性（48.7%）和特异性（90.2%）均高于传统的肿瘤标志物（癌胚抗原、糖类抗原19-9和糖类抗原125）。另外，外泌体来源的circ_0051443表达在HCC患者血浆中下调，可抑制HCC的进展，其诊断HCC的AUC为0.808 9[39]。

LI等[28]发现，小细胞肺癌患者血清外泌体FECR1异常上调，发生远处转移的患者外泌体FECR1表达水平更高，且血清FECR1水平与小细胞肺癌患者的化疗反应密切相关。因此，FECR1可作为评估小细胞肺癌进展的生物标志物。WANG等[40]发现肺腺癌患者血清外泌体circ_002178显著上调，通过吸附miRNA-34和miRNA-28-5p增强细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PDL1）表达，circ_002178可作为肺腺癌的非侵入性诊断标志物，其AUC为0.996 7。CHEN等[41]全面分析了肺腺癌组和健康对照组血浆外泌体circRNA的表达谱，发现circ_0001492和circ_0001346的表达水平在早期肺腺癌中上调，但在健康对照组的血浆外泌体中几乎检测不到，这提示circ_0001492和circ_0001346或可作为新型肺腺癌早期候选诊断标志物。

有学者采用生物信息学分析和实时荧光定量聚合酶链反应技术发现circ_00005795和circ_0088088可能起竞争内源性RNA的作用，通过对比乳腺癌患者和健康对照者血清外泌体circRNA的表达，2种circRNA对乳腺癌均具有重要的诊断价值，为预测乳腺癌的发生、发展和转移提供了理论基础[42-43]。除此之外，外泌体来源的circRNA对前列腺癌[15]、胰腺癌[21-22]、膀胱尿路上皮癌[23]、胆管癌[27]、子宫内膜癌[44]、甲状腺癌[45]、食管鳞状细胞癌[46]等恶性肿瘤也有重要的诊断价值。这为寻找针对不同肿瘤的强有力的诊断标志物提供了新的方向。尽管外泌体circRNA成为新型肿瘤标志物的潜力巨大，但目前对外泌体circRNA的了解仍处于起步阶段，而且大部分研究只是提出了新思路，这些分子是否可以成为肿瘤标志物仍需要进一步研究验证。circRNA在不同肿瘤中的应用见表2。

表2 外泌体来源的circRNA在不同肿瘤中的应用

续表2

5 结论

外泌体circRNA可调节肿瘤细胞的增殖、转移和耐药，是肿瘤研究的新热点。更重要的是，circRNA具有高度保守的特征和组织/发育特异性表达模式，可在外泌体中富集，能从体液中检测到。因此，除了揭示肿瘤的发病机制外，探索外泌体和circRNA的联系还有助于寻找新的潜在的肿瘤生物标志物或治疗靶点。目前，仅有少数circRNA具有确定的功能或临床应用价值。与mRNA和miRNA相比，我们对外泌体circRNA的认识还是有限的：大量的外泌体circRNA及其作用机制尚未被发现和揭示；在现有的一些研究中，外泌体circRNA对不同肿瘤的诊断价值尚缺乏实验验证；与循环游离circRNA相比，外泌体circRNA的优势也尚未被验证。因此，外泌体circRNA作为未来研究的热点之一，其临床应用价值还需要有足够的理论研究结果来支持。