缝隙连接细胞间通讯在丙戊酸诱导大鼠脂肪源干细胞向许旺细胞分化中的作用

吴飞，焦传杰，杨越，刘丰，孙志博

丙戊酸是经典的抗癫痫药，本课题组前期研究显示其具有神经元保护作用[1,2]，并能有效地诱导大鼠脂肪源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）向许旺细胞分化[3]，但其具体的调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨缝隙连接细胞间通讯在丙戊酸诱导ADSCs 向许旺细胞分化中的作用，以进一步阐明其在神经诱导中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

DMEM 培养基、胎牛血清购于GIBCO公司，油酸酰胺、丙戊酸钠、胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购于美国Sigma 公司，兔抗鼠神经组织蛋白S100、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）、缝隙连接蛋白43（Connexin 43，Cx43）抗体购于Santa Cruz公司，RT-PCR试剂盒购于TOYOBO公司，2×Taq PCR MasterMix购于Fermentas公司，羊抗兔IgG、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs 的分离、培养、鉴定 取4 周龄SD大鼠10只，无菌取出适量的背部皮下脂肪，PBS漂洗，剪碎，用0.075% I 型胶原酶消化30 min，等量低糖DMEM 培养基终止消化，1500 r/min 离心10 min 后弃上清，以DMEM完全培养基重悬细胞，种于培养瓶内，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2天换液1次，细胞接近融合状态时，以0.25%胰酶消化、传代，取第3 代细胞进行后续实验。

1.2.2 诱导大鼠ADSCs 向许旺细胞分化 以含10 ng/mL 碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的培养液预诱导24 h，再用PBS 液漂洗，根据分组情况，将ADSCs分别用不含丙戊酸（A组）、含1.0 mmol/L丙戊酸（B组）、1.0 mmol/L丙戊酸+2.5 μmol/L油酸酰胺（C组）的诱导液培养7 d，每隔24 h换液。

1.2.3 MTT法检测各组细胞增殖情况 调整细胞浓度为5×104/mL，接种至96孔板，每组各10孔。在24、48、72 h这3个时间点每孔各加入20 μL MTT溶液，孵育4 h离心后弃上清，加入150 μL DMSO，在波长490 nm 下使用酶联免疫检测仪记录各孔吸光值。……