一起兔巴氏杆菌病的诊断

葛向平

（山东省胶州市动物疫病预防与控制中心，山东 胶州 266300）

兔多杀性巴氏杆菌病是由兔多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起的一种接触性、急性传染病，由于病原的感染部位不同而呈现败血症、传染性鼻炎、地方流行性肺炎、子宫积脓、睾丸炎和脓肿等病症。该病呈散发性、多形性或地方流行性[1-2]。一般无季节性，在气温骤变及多雨季节容易发病，是严重危害养兔业的重要细菌性传染病之一[3]。

1 发病情况

2020年10月，胶州一农户饲养的20只3月龄兔，出现食欲废绝、咳嗽、呼吸困难、打喷嚏、流鼻涕。发病兔腹泻，排绿色稀便，眼结膜充血，个别兔出现四肢抽搐、歪头等神经症状，死亡5只，其它兔个别精神不振。

2 剖检症状

剖检死亡兔可见肺出血、气管环出血，肝脏肿大，表面有灰黄色或灰白色坏死点，脾脏呈现暗红色，表面有出血点，肠黏膜充血，有出血点。

3 实验室诊断

3.1 涂片检查 无菌取发病兔肝脏、脾脏剪碎，制成涂片，经革兰氏染色后，镜检，显微镜下发现大小一致、两端钝圆的球杆状或短杆状革兰氏阴性菌。

3.2 细菌分离培养 无菌取发病兔肝脏分别接种于含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板和麦康凯培养基中，37 ℃培养24 h后，可见麦康凯培养基中没有菌落生长，而在含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良马丁肉汤琼脂平板上生长良好，菌落边缘整齐，光滑、湿润、灰白色菌落。分离菌用革兰氏染色后在显微镜下观察，可见两端钝圆的革兰氏阴性短小杆菌，均符合巴氏杆菌培养特性。

3.3 生化鉴定 （1）糖发酵试验：取分离菌株接种糖发酵管培养基，37 ℃ 培养24 h后观察结果，能发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖，不发酵乳糖。（2）吲哚试验：将分离菌株接种于色氨酸肉汤培养基，37 ℃ 培养24 h，滴加Kovacs靛基质试剂2～3滴，立即观察结果，反应阳性。（3）氧化酶试验：取一片氧化酶试纸，用一滴无菌水润湿试纸，用玻璃棒或一次性塑料接种环挑取分离菌株涂于纸片上，观察1 min，呈阳性反应。

3.4 PCR鉴定 （1）引物设计：参照文献[4]设计多杀性巴氏杆菌PCR鉴定引物，扩增片段长度为460bp，序列如下：F：5’-ATCCGCTATTTAC CCAGTGG-3’，R：5’-GCTGTAAACGAACTCG CCAC-3’。（2）PCR样品处理：取分离菌加入含10μl双蒸水的小离心管中，95 ℃ 加热10 min，冰浴10 min后作为PCR扩增模板，用双蒸水作阴性对照。（3）PCR扩增及电泳：反应体系：模板 2 μl，10 × PCR Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mM dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶0.3 μl，然后加水至25 μl。反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性1 min，55 ℃ 复性1 min，72 ℃ 延伸2 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min，转入4 ℃ 终止反应。经1 % 的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，被检样品出现460 bp大小的DNA带，阴性对照无条带。

4 结论

通过临床诊断和实验室诊断，确诊该养殖户病兔为巴氏杆菌感染，兔巴氏杆菌病是威胁养兔业的严重疫病，为避免该疫病的发生，应及时做好防控工作，按时免疫，一旦发现疾病，立即采取措施，进行治疗与控制。