蛋白酶K预处理在SARS-CoV-2核酸提取中的应用探讨*

王 念，巫丽娟，周 易，宋兴勃，叶远馨，钟慧钰，周汶静，陶昕彤，刘堂喻亨，宋佳佳，斯艳君，陆小军，应斌武

四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的迅速传播，已严重危害人类健康。早期实验室诊断可及时隔离新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者及其密切接触者，打破传播链[1-2]。同时，早期诊断和治疗可使患者有更好的结局[3]。大多数临床实验室采用实时荧光定量PCR(qPCR)对SARS-CoV-2进行核酸检测[4]。然而，SARS-CoV-2核酸检测的阳性率并不高。其中，核酸提取效率是影响其检出率的重要因素之一。因为蛋白酶K(PK)可对生物标本中的蛋白质进行消化，同时还可降解标本中的RNA核酸酶，阻止RNA被降解，对标本进行PK预处理可能会提高核酸的提取效率，从而降低其循环阈值(Ct值)，提高阳性检出率。因此，本文就核酸提取前预处理是否需要加入PK进行探讨。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取本院2020年1月25日至6月30日临床上收集的COVID-19患者(根据SARS-CoV-2相关指南确诊)[4]的核酸阳性标本共70份，其中包括50份鼻咽拭子标本和20份粪便标本。

1.2仪器与试剂 鼻咽拭子含植绒拭子及3 mL保存液购自深圳海尔施生物医药股份有限公司；病毒RNA提取采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统(购自法国生物梅里埃公司)；PK试剂购自瑞士罗氏公司；SARS-CoV-2检测试剂购自湖南圣湘生物科技股份有限公司，采用SLAN-96P仪(购自上海宏石医疗科技有限公司)进行qPCR扩增。

1.3标本处理与提取 所有标本先经过56 ℃、30 min 灭活。 鼻咽拭子标本：取出标本后混匀保存液，分别取2份1 mL待测标本于1.5 mL小型离心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份则直接在56 ℃下孵育30 min。……