烤烟根腐病对烟株根际土壤真菌群落结构的影响

郑元仙 杨敏 王继明 许银莲 蔡宪杰 黄飞燕 童文杰 陈小龙 余磊 何元胜

摘要：為从微生物生态学角度探求烤烟根腐病的发生原因并为其防控提供理论依据，利用Illumina Miseq高通量测序分析了烟草根腐病发病和健康植株根际土壤真菌群落结构的差异，结果表明，烤烟根腐病发生对烤烟根际士壤真菌的丰富度有显著影响，其中健康和患病烟株根际土壤样品中真菌OTU数分別为904个和647个，健康烟株真菌OTU总数为患病烟株的40倍，特有OTUs数是患病烟株的2.59倍;患病烟株根际土壤真菌群落多样性水平显著低于健康烟株土壤，患病烟株根际土壤的Shannon、ACE和Chaol指数分別较健康植株降低了29.81%6、40.12%6和40.61%;同时，患病烟株与健康烟株根际土壤真菌群落的优势物种显著不同，患病烟株根际土壤中烤烟根腐病病原菌茄镰刀菌（F.solani）相对丰度较健康烟株根际土壤增加了303.45%，为健康烟株的4.03倍，且棘孢木霉（7 ichoderma asperella）和青霉菌（Penicillium raper）的相对丰度亦较健康烟株分别增加了17.62%和50.46%。烟草植株根际土壤中真菌群落结构改变及物种多样性降低是烤烟根腐病发生的重要特征。研究可为该病害的早期预防或生态调控提供科学依据。

关键词：烤烟;根腐病;根际生物;群落结构;多样性

烟草是云南重要的经济作物之一。由镰刀菌属（Fusarium spp）真菌侵染引起的烤烟根腐病是云南临沧等植烟区重要土传病害之一，发病烟株叶片变黄，茎秆变黑，维管束常变黑坏死，根系腐烂，严重时烟株常整株枯死山。该病在临沧部分植烟区发病率为15.5%～56.3%，严重影响了烟叶的产量与质量。目前生产中尚无有效的防治根腐病方法。因此，寻求该病害早期预防或生态调控措施尤为迫切。

土壤是作物生长的基础，同时也是土传病原物和各类土壤微生物栖息的重要场所。根际土壤微生物与土传病原物同时生长在一个环境中，二者互作会对植物病害的发生和发展产生直接或间接影响。大量研究表明，土壤微生物的数量和活性与土传病害的发生存在一定联系，在微生物多样性丰富的土壤中病原菌较难生存，而土传病害的发生也会导致土壤微生物的多样性降低。研究表明，健康植株与患病植株根际微生物在数量上存在一定差异。同时，根际微生物与植物抗病性也有着密切的关系，研究发现通过调节土壤微生态可以很好地防治烟草青枯病的发生，黄瓜根际土壤的某些真菌对黄瓜土传病害有防治作用。由此可见，了解病原菌与根际其他微生物的功能及二者互作关系对土传病害的防治具有重要意义。

根际微生物组成复杂、活性高，常被称为植物的第二基因组，而高通量测序技术具有获得的信息量大、样品间平行性好等优点，可快速、准确、全面地探究样品中微生物的群落种类、数量，获取更加丰富的微生物多样性信息。因此，本研究采用Illumina Miseq高通量测序技术分析健康烟株与患烤烟根腐病烟株根际土壤真菌群落多样性的差异，旨在从微生物生态学角度分析烤烟根腐病的发生原因，并为该病害的有效预防或生态防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验地点

供试土壤样品于2018年7月采集于云南省临沧市耿马县勐撒镇烤烟植烟区（99°232”E，23°3340N），试验区植烟土壤类型为红壤，土壤质地为轻黏土，供试烤烟品种为云烟87，试验区施肥及其他田间管理措施一致，均参照当地优质烟叶生产管理办法执行。

1.2土样采集

选取烤烟根腐病典型发病烟田，在同一地块中（自然条件及土壤性质相似）选取具烤烟根腐病典型症状的烟株和健康烟株各3株，收集附着在根上04mm的土壤作为根际土，分别命名为Pathogen（发病土）和Health（健康土），去除土样中的杂物、细根后放入自封袋中（各烟株根际土样单独保存），立即置于液氮中运回实验室，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3土壤真菌多样性的测定

1.3.1基因组DNA的提取和PCR扩增参照FASTDNARSPINKitforSoil（MP，USA）土壤基因组DNA提取试剂盒的步骤提取各根际壤样品DNA，DNA浓度和纯度利用Nanodrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。使用弓ITS1F（5'ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）/ITS2R（5'-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）对18SIRNA基因的ITS-1可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3min;95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45，36个循环;72℃延伸10min。扩增体系为20uL：4uL5×Fastpfu缓冲液;2uL2.5mmol/LDNTPS;0.8uLForwardPrimer（5umol/L）;0.8HLReversePrimer（5umol/L）;0.4ulFastpfu：聚合酶;02HLBSA10ngDNA模板;加dHO至20uL。使用2%6琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyprepDNAGelExtractionKit（Axygen，USA）试剂盒进一步纯化回收后，送上海美吉生物医药科技有限公司进行Mise测序。

1.3.2数据的质控与分析原始测序序列使用Irimmomatic软件质控，用FLASH软件进行序列拼接;通过Search软件（Version7.0）过滤并去除嵌合体序列得到有效序列;用Uparsell软件（Version7.1）在97%的相似性水平上划分操作分类单元;代表序列用RDPclassifier软件刚和SIVA数据库进行物种注释，利用Mothur软件（versionV.1.30.1作稀释度曲线，计算文库覆盖率Coverage）、Shannon、Simpson、ACE及Chaol指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价;利用Qime软件（Version1.7.0）建立的Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析（PCOA）。

2結果

2.1真菌的OTU丰度和Alpha多样性

在97%相似水平上土壤样品真菌群落OTU丰度和多样性指数如表1所示，香农指数稀释度曲线显示（图1），随着测序数量的上升，稀释度曲线斜率逐渐下降，趋向平坦，说明测序数量足够。覆盖率（Coverage）是指样本中序列被检测出的概率，其值越高，代表本次测序结果越符合样本中微生物的实际情况，在本试验中，2个处理的覆盖率分别为9%和99.91%（表1），表明测序读长足以进行此项分析。

患病和健康烟株根际土壤样品中真菌的OTU丰度分别为647个和904个，健康烟株根际土壤的真菌OTU丰度是患病烟株的1.40倍（表1）。真菌OTUs分布韦恩图表明，两个处理根际土壤中一共有1551个OUs（图2），共有的OTUs为485个，只占总数的31.27%，健康烟株根际土壤所特有的OUs数是患病烟株的2.59倍，说明病害的发生明显降低真菌OTU丰度。此外，病害的发生对烤烟根际土壤真菌的丰富度和多样性均有显著影响。患病烟株根际土壤的Shannon指数较健康烟株降低了29.81%，Simpson指数升高了69，23%，说明患病烟株根际士壤真菌群落多样性水平低于健康烟株土壤（Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，群落多样性越高）。除群落多样性外，病害的发生还会造成烤烟根际土壤真菌群落的丰富度显著降低，患病烟株根际壤的ACE和Chao1指数较健康烟株分别降低了40.12%和40.61%6，差异均达显著水平（p《0.05）。

2.2真菌的群落种类组成及相对丰度

各处理根际土壤样品中真菌在门（Phylum）分类水平上物种相对丰度堆积柱形图如图3所示。由图3可知，不同处理烟株根际土壤真菌区系在门水平上主要由子囊菌门（Ascomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）组成，二者均占各处理总量的90%以上。但患病烟株根际土壤中子囊菌门相对丰度较健康烟株增加了4.23%，而被孢霉门和担子菌门相对丰度却较健康烟株分别减少了12%和45.42%。

由图4可知，患病烟株根际土壤真菌区系在属水平上主要由木霉属（Trichoderma，36.97%）、镰刀菌属（Fusarium，28.50%）、被孢霉属（Mortierella，6.48%）和青霉属（Penicillium，5.13%）组成，四者约占总量的77.08%;而健康烟株根际土壤真菌在属水平上则主要由木霉属（33.12%）、镰刀菌属（14.37%）、被孢霉属（8.14%）、青霉属（3.33%）、unclassified k Fungi（3.78%），unclassified pAscomycota（4.73%）和枝顶孢霉属（Acremonium3.37%）组成，七者约占总量的70.84%。病害对烤烟根际土壤真菌群落的相对丰度影响较大，易造成某些优势菌群的大量繁殖，患病烟株根际士壤中木霉属、镰刀菌属和青霉菌属的相对丰度分别是健康烟株根际土壤的1.12、1.98和1.54倍。说明病害的发生对烤烟根际土壤真菌群落分布具有一定影响，可造成部分真菌属水平上的比例失衡。

从种的分类水平看（图5），木霉属真菌主要分布于棘孢木霉（L.asperella），镰刀菌属真菌主要分布于茄镰刀菌（Fsolani）和unclassified Fusariun，青霉属真菌主要分布于青霉菌（Praper）患病烟株根际士壤中棘孢木霉（35.65%）和茄镰刀菌（18.72%）相对丰度之和为54.37%，而健康烟株根际土壤中二者相对丰度分別为30.31%和464%，仅占总量的3495%。烤烟根腐病病菌茄镰刀菌（solani）在患病烟株根际士壤中积累明显，相对丰度较健康烟株根际土壤增加了303.45%，约为健康烟株的4.03倍。同时，患病烟株根际土壤中棘孢木霉和青霉菌的相对丰度亦较健康烟株增加了17.62%和50.46%。总体看来，病害对烤烟根际土壤的真菌群落组成及相对丰度均有显著影响。

2.3真菌群落组成的PCoA聚类分析

PcoA主成分分析表明（图6），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）对样品差异性的解释度分别为43.14%6和27.05%，两者总计可解释全部壤样品的70.19%。总体看来，患病烟株根际土壤真菌群落（Pathogen）主要分布在PC2的正值区域，而健康烟株根际土壤真菌群落（Health）主要分布在PC2的负值区域，进一步说明患病烟株与健康烟株根际土壤真菌物种组成存在明显差异。

3讨论

土壤微生物是土壤中最活跃的生物体，对土壤环境变化敏感，在一定程度上反应着土壤质量和生态功能的变化，土壤微生物多样性和群落结构稳定性是评判土壤生态系统健康的重要指标。土传病害的病原菌栖息于壤中，难以根除，病原菌与植物根际微生物生长在同一个环境中，病原菌与根际其他微生物类群之间营养物质、生态位等有限资源的竟争常造成各微生物群落分布比例失衡。从生态学角度开展土传病害发生与根际土壤微生物多样性关系的研究表明，土壤微生物多样性的丧失易导致植物土传病害增加22，而高微生物多样性和活性有利于促进植物生长23-2，增强植物自身抗性并抑制土传病害的发生。本研究中患烤烟根腐病烟株根际壤Shannon、ACE和Chaol指数分别较健康植株降低了29.81%、40.12%和40.61%;烤烟根腐病病原菌茄病镰刀菌（E solani）在患病烟株根际土壤真菌群落中占绝对优势，其相对丰度为健康烟株的4.03倍，显示根际土壤中病原菌大量繁殖、真菌群落多样性和丰富度明显降低是烤烟患根腐病的重要特征。这与罹病玉米植株根际真菌区系中病原菌占绝对优势，其他种真菌很少，根系微群落已转化为病理组合的研究结论相似。总体看来，植物根际士壤微生物群落是一个综合体，病害的发生与群落结构失衡密切相关。

研究指出，植物抗病性除与其形态结构和生理生化代谢有关外，还与根际微生物有着密切关系，植物根际中可能存在着大量的拮抗微生物。本研究中，患病烟株根际土壤中茄病镰刀菌（Fsolan）显著增加的同时，棘孢木霉（T：asperellum）和青霉菌（PTaper）的相对丰度亦较健康烟株也有不同程度增加，二者增量分别为17.62%和50.46%，木霉属（Trichodermaspp）真菌具有解磷、解钾和固氮等作用，可通过竞争、重寄生、抗生和诱导宿主抗性等作用抑制病原体，是一类重要的生防真菌2青霉属（Penicilliumspp）真菌可参与有机物的分解，促进C、N、P等多种元素的循环，还能产生多种重要的活性代谢产物，降解多种环境有害物质2相关研究表明，该类真菌均可对部分镰刀菌属（Fusariumspp）表现出明显抑制作用28-2。这可能是植物病原菌侵染时为抵制病害发生，而引起的植物自身抗性或其根际生态系统抗性响应的结果，但这两种微生物对茄病镰刀菌（F.solani）是否存在明显的拮抗作用以及其作用机理还有待进一步研究。

4结论

本研究表明，烟草植株根际土壤中真菌群落结构改变及物种多样性和丰富度降低是烤烟根腐病发生的重要特征，烟株根际生态系统失衡可能是促进病原菌大量繁殖并进一步加重病害发生的原因。因此，通过采取有效措施重塑稳定和更多样化的根际微生物群落结构，进而提升烟株根际生态抗性来预防或减轻土传病原菌的危害可作为烤烟根腐病的防控途径之一。此外，健康烟株根际微生物中拮抗微生物筛选，以及各种微生物尤其是优势菌种与病原菌及其他有益微生物之间的相互关系的进一步研究，也将为有效利用植物生态调控措施防治烤烟根腐病提供新的思路和科学依据。

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