癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx表达水平及临床意义

郑希院，赵志敏，薛林霞，赵龙斌

癫痫是一种常见的神经系统疾病，主要是由多种原因导致脑细胞群异常超同步化放电，造成突然性、暂时性及发作性脑功能紊乱，目前关于癫痫的发病机制未完全明确[1]。miR可调控细胞生物增殖、代谢、发育、凋亡、应激、代谢等过程，与癫痫发生与发展等密切联系，其中miR-146a是调控炎症反应及免疫的调控因子，在癫痫中发挥重要作用[2]。脑内miR-124含量较多，在成熟及发育神经系统中均有表达，miR-124可能参与调节突触可塑性，且在异常神经网络形成中调节神经再生长及轴突生长[3]。白介素-1(interleukin-1，IL-1)在组织修复与免疫应答中发挥作用[4]。双皮质素(double corte x，Dcx)是在多数树突末端与轴突末端具有特殊的亚细胞位置，Dcx在神经元移行过程中发挥关键作用，可调节神经元发育[5]。本研究分析癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年4月—2018年4月我院收治的癫痫病人90例，男51例，女39例，年龄10～47(28.5±5.5)岁；病程0.5～19(9.7±0.5)年；单纯部分性发作19例，复杂部分性发作28例，全身强直阵挛性发作43例；单次发作(每个月<4次)36例，频繁发作(每个月≥4次)54例；癫痫轻度(2个月发作1次)18例，中度(1个月发作<4次)29例，重度(1个月发作>4次)43例。另选取同期在我院进行健康体检者90名作为正常组，男49名，女41名；年龄8～48(28.2±4.7)岁。两组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 癫痫发作类型及诊断标准符合国际抗癫痫联盟的诊断分类标准；癫痫诊断根据病人家族史、体格检查、现病史、脑电图、颅脑MRI或CT等相关检查结果，并由神经内科专业医师确诊；所有癫痫病人或家属知情并同意加入本研究。

1.2.2 排除标准 合并精神分裂症、双相障碍等其他精神疾病史病人；癫痫病人伴有神经及其他系统疾病；听力、视力障碍及失语等病人；近期服用过抗焦虑抑郁情绪及影响认知功能药物的病人。

1.3 方法

1.3.1 IL-1水平检测 采集所有研究对象晨起空腹外周静脉血5 mL，置于一次性真空无抗凝剂的采血管中。20～25 ℃条件下进行凝血60 min，之后以1 500 r/min离心20 min，分离血清，-80 ℃环境中保存待检。IL-1水平采用酶联免疫吸附法测定：缓冲液稀释50 mol/L碳酸盐包IL-1抗原，之后添加到聚苯乙烯反应板孔中，置于24 h温度4 ℃，次日洗涤剂洗涤3次后，抛干。各孔中加入稀释液稀释的待测标本0.1 mL，同时加入阳性和阴性对照标本，42 ℃放置60 min，将液体移除洗涤3次后，抛干。各孔中加入IL-1酶标抗体0.1 mL，43 ℃放置60 min。液体移去，洗涤3次，抛干。在各个孔中加入0.1 mol/L的Na2HPO4与0.05 mol/L枸橼酸滴液混匀，再加入0.1 mL邻苯二胺，遮光处理20 min，在各孔中加入2 mol/L H2SO40.05 mL，终止反应。使用酶标仪检测405，分析IL-1水平。

1.3.2 miR-146a、miR-124、Dcx水平检测 按照TRIzol提取细胞RNA，总RNA浓度测定采用紫外分光光度计，重复测定3次。按照QIAGEN进行反转录合成cDNA：取14 μL RNA，5×RT缓冲液4 μL，2 μL Enzyme mix，42 ℃反应60 min，95 ℃反应5 min，cDNA合成后-20 ℃环境下保存备用。使用ABI7500聚合酶链式反应(PCR)仪按照说明书将cDNA进行PCR扩增，U6作为内参，95 ℃ 15 s进行循环扩增，95 ℃ 5 s，60 ℃退火加延伸30 s，共40个循环，调节基线，miRNA、miR-124、Dcx与内参U6的相对表达量以2-△△Ct表示。

2 结 果

2.1 两组miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 与正常组比较，癫痫组miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表1 两组miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

2.2 不同性别的癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 男性癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量与女性癫痫病人比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 不同性别的癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

2.3 不同年龄的癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 <18岁癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量与≥18岁癫痫病人比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 不同年龄的癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

2.4 不同发作类型癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 与单纯部分性发作比较，复杂部分性发作、全身强直阵挛性发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与复杂部分性发作比较，全身强直阵挛性发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表4。

表4 不同发作类型癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

2.5 不同发作频率癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 与单次发作比较，频繁发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平表达升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表5。

表5 不同发作频率癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

2.6 不同发作程度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较 与轻度癫痫病人比较，中度、重度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与中度癫痫病人比较，重度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表6。

表6 不同发作程度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量比较(±s)

3 讨 论

目前癫痫主要涉及癫痫病程、部位、发作类型及发作频率，包括神经网络异常及社会因素等[6]。癫痫病人不仅对发作症状治疗与控制，还包括对癫痫病人精神性疾病及合并神经系统疾病管理[7]。有研究显示，癫痫病人常见的合并症是抑郁、焦虑与认知功能障碍，若降低病人自我管理依从性与对抗癫痫药物耐受性，病人可能增加意外死亡及自杀风险，给家庭与社会带来沉重的经济负担[8]。癫痫发病电生理基础是神经元异常放电，导致短暂的大脑功能障碍[9]。癫痫发作临床表现复杂多样，主要是由于异常放电的传递方式与起始部位不同，临床表现为精神障碍、发作性运动、自主神经等[10]。癫痫与炎性因子互相发展、促进，炎性因子促进癫痫发作与神经细胞兴奋，而癫痫发作也引起炎症反应[11]。

miRNA参与细胞胚胎发育、增殖、凋亡与分化等重要的过程，与下游靶基因和上游调控因子之间形成复杂的调节机制。miR-146a在癫痫发病机制中发挥重要作用，其在脑组织与炎症反应密切关系[12]。miR-124参与轴突生长与神经细胞骨架结构的调节，降低α-微管蛋白表达[13-14]。miR-124影响认知功能是由于其参与突触长时程可塑调节，在癫痫病人中呈高表达，参与癫痫后突触重塑过程[15]。IL-1是一种促炎细胞因子，癫痫后通过星形胶质细胞对神经元的间接作用或通过对神经元的直接作用参与癫痫形成过程，是由于通过加强谷氨酸神经传递，提示炎症反应对癫痫发生与发展发挥重要作用[16-17]。Dcx在多数树突与轴突末端发挥抑制作用，它影响配体复合物，提示在神经元突起的生长作用[18]。本研究结果显示，与正常组比较，癫痫组病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量升高。说明癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx相对表达量更高。

本研究结果显示，与单纯部分性发作比较，复杂部分性发作、全身强直阵挛性发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高；与复杂部分性发作比较，全身强直阵挛性发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高。说明全身强直阵挛性发作miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平更高。张淑红等[19]等研究显示，在癫痫大鼠模型发作后，马海组织miR-146a在星形胶质细胞活化区域内表达量较高，与本研究结果一致。本研究结果显示，与单次发作比较，频繁发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平表达升高。说明频繁发作癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平更高。相关研究表明，炎性递质可调节兴奋性氨基酸释放，提高神经元细胞兴奋性，促进癫痫发作[20]。本研究结果显示，与轻度比较，中度、重度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高；与中度比较，重度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx水平升高。说明重度癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx表达水平更高。

综上所述，癫痫病人miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx呈高表达，其表达水平与发作频繁、发作类型、发作程度相关，miR-146a、miR-124、IL-1、Dcx在癫痫病人中起到重要的参与作用。