VPS4B 调控Notch 通路对促进牙髓干细胞成牙本质分化的机制研究

李坤阳陈 栋左春然刘爱群朱兰省牛 兵

(1.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)口腔科,郑州 450001; 2.郑州大学第一附属医院·河南省口腔医院口腔科,郑州 450052)

人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)是从牙齿上分离出的成体间充质干细胞,具有高度增殖能力,且具有多向分化潜能,是牙齿再生的重要细胞[1]。 因此hDPSCs 的定向分化对于牙齿再生至关重要。 细胞液泡分选蛋白 4B(vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)在 hDPSCs 中高表达,可促进向成牙本质分化,但机制尚不明确[2]。Notch 通路与细胞增殖、分化等关系密切,并且几乎涉及机体所有器官、组织和细胞,在牙齿发育和再生过程中发挥重要作用[3-4]。 Notch 受体释放其胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)作为Notch 通路激活金标准,过表达 NICD 可以抑制hDPSCs 分化[5]。 推测 VPS4B 可能调控 Notch 通路影响hDPSCs 成牙本质分化。 因此,本研究采用矿化液和干扰VPS4B 同时处理hDPSCs,探讨其对成牙本质分化的影响,并初步探讨其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集本院18 ～30 岁因正畸或阻生齿拔除的健康完整恒牙,无菌工作台上取出牙髓,分离纯化和鉴定得hDPSCs[6]。 经核实,所有操作经患者知情同意并签订知情同意书,本研究经本院伦理协会审核并通过(20190014)。

1.2 主要试剂与仪器

地塞米松、维生素、β-甘油磷酸钠、茜素红(德国 Sigma 公 司, 批 号 分 别 为: 170412、 181113、171207、180415);脂质体 Lipofectamine 2000 转染试剂盒(赛默飞世尔公司,批号:20170418);一抗VPS4B、NICD、hairy 相关转录因子 1(hairy and enhancer of split-related with YRPW motif1,Hey1)、GAPDH、钙浓度检测试剂盒(美国abcam 公司,批号分 别 为: ab224736、 ab83232、 ab22614、 ab181602、ab102505);VPS4B-siRNA、阴性对照 siRNA、Runt 相关转录因子2 (runt-related transcription factor2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoproprotein,DSPP)引物序列均由生工生物工程股份有限公司合成。 CO2培养箱(深圳瑞沃德公司,型号……