猪乳外泌体对猪流行性腹泻病毒的抑制作用

陈婷 谢梅英 魏立民 欧阳坤 程晓 张永亮

（1. 海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海口，571100；2. 生猪种业中心 广东省动物营养调控重点实验室 华南农业大学动物科学学院，广州，510642；3. 广东生态工程职业学院，广州，510520）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起猪腹泻的主要病原之一，对仔猪的致死率高达100%，给养猪业造成巨大经济损失。截止目前，猪流行性腹泻的治疗尚无特效药，生产中以综合性预防手段为主［1］，研究显示，仔猪可从乳中获得母源抗体而得到被动免疫保护，黏膜免疫在抵抗肠道病毒PEDV的感染中发挥重要作用，可诱导产生分泌型IgA（sIgA），有效抵御病毒入侵［2］。

Exosome是一类由内吞作用形成的膜上小囊泡，可通过融合多泡体（multivesicularbodies，MVB）而释放到细胞外环境［3］，在透射电镜下呈圆形或杯状磷脂双分子层结构，直径为40-100 nm［4-5］。研究显示，exosome可携带细胞特异性生物分子，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白质，并分泌出细胞［6］，人和牛乳汁exosome中的mRNA、miRNA可以转运进入免疫细胞，并潜在地调控免疫细胞功能［7-8］。同时，包裹在外泌体中的乳汁miRNA可以稳定的抵抗人类消化系统的恶劣环境，并渗透进肠上皮Caco-2细胞单层屏障到达血液循环，最终作用于细胞功能［9］。人乳exosome可以抵抗消化进而被肠细胞吸收，最终在细胞核的位置发挥作用影响基因表达［10］。本课题组在2016年报道了猪乳exosome可能通过其包裹的miRNAs、mRNAs及蛋白质等组分，调控相应的基因和蛋白表达，最终促进肠道上皮细胞增殖［11］。同样，Alison等［12］也报道了大鼠乳exosome可以增强IEC-18细胞的活力，促进增殖，刺激肠干细胞活性。然而，至今仍未见乳exosome在肠道细胞上调控PEDV病毒的报道。因此，本研究拟从细胞水平上探索猪乳exosome对PEDV的抑制作用，并进一步对其作用方式和作用途径进行解析，以确定猪乳exosome对仔猪的肠道保护功能，为进一步揭示乳生物学功能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

仔猪小肠上皮细胞 IPEC-J2完全培养基：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+5 ng/mL EGF +5 μg/mL 胰岛素+1%双抗（由四川农业大学陈代文老师实验室馈赠）。

1.2 方法

1.2.1 PEDV的繁殖 Vero E6细胞（非洲绿猴肾上皮细胞系，本实验室已保存）：DMEM+100单位/mL青/链霉素+10%胎牛血清FBS。PEDV CV777由本校生猪种业工程中心实验室提供。

将保存的PEDV（strain CV777）毒株用含2.5 μg/mL胰酶的无血清DMEM稀释1 000倍后，接种至长成单层培养的非洲绿猴肾细胞系（Vero E6），37℃吸附2 h后，加入含2%血清的DMEM在37℃、5% CO2培养箱继续培养，72 h后收毒。将含有病毒液的细胞瓶置于-20℃冰箱，待病毒液结冰后，放置室温，等完全融化后，再置-20℃冰箱，反复冻融3次。收获的病毒悬液1 000 r/min离心10 min去除细胞碎片，收集病毒液上清，分装后，-80℃保存备用。

1.2.2 猪乳exosome提取 收集10头未免疫猪流行性腹泻病毒疫苗的健康长白母猪分娩后0-5 d内乳汁200 mL，2 000×g，4℃，30 min离心收集上清，除去乳脂蛋白和乳腺细胞碎片后；将收集到的乳清按12 000×g，4℃，离心30 min，收集上清，去除乳脂蛋白、酪蛋白和其他细胞碎片；将收集到的乳清按110 000×g，4℃，进行超高速离心2 h，去除上清部分，获得猪乳外泌体并存于-80℃备用。

1.2.3 结晶紫检测

（1）IPEC-J2细胞分别按照2.5×104/cm2密度接种于24孔板，每组10个重复；按下述3种处理方式处理完后，吸去并弃掉培养基，PBS涮洗2次；每孔加入500 μL 10%甲醇，静置 2 min，弃掉甲醇溶液，并晾干；每孔加入200 μL结晶紫染液，静置10 min；轻轻甩去染液，PBS洗涤2次后，倒置于吸水纸上吸干水分，置于显微镜下观察拍照；拍照结束后，每孔加400 μL 33%的醋酸脱色，充分溶解后，每孔取200 μL在570 nm处测定光吸收度。

（2）将细胞分为PEDV组（对照组）和PEDV +exosome组（实验组），猪乳exosome按照预防、杀毒及感染后修复3种目的处理细胞，具体设计要求如下。

Group1（预防作用）：实验组先添加含2.5 mg总蛋白的猪乳exosome（以蛋白质含量为计量单位，下同）处理细胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2细胞2 h；对照组先添加与猪乳exosome等体积的DMEM/F12培养基处理细胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染细胞2 h，处理完72 h 后检测（感染前添加）。

Group2（杀毒作用）：实验组先进行等体积包含2.5 mg总蛋白的猪乳exosome与0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2细胞，混合后室温静置10 min，感染细胞2 h；对照组进行等体积的DMEM/F12培养基与0.1 MOI PEDV感染IPEC-J2细胞，混合后室温静置10 min后感染细胞2 h，处理完72 h 后检测（同时添加）。

Group3（修复作用）：实验组先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2细胞2 h，再添加包含2.5 mg总蛋白的猪乳外泌体处理72 h 后检测；对照组先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2细胞2 h，再加入与猪乳exosome等体积的DMEM/F12培养基处理72 h 后检测（感染后添加）。

1.2.4 MTT检测 仔猪小肠上皮细胞IPEC-J2按照2.5×104/cm2密度接种于96孔板，每组12个重复；待细胞完全贴壁后生长至融合度50%-60%时，添加处理物进行处理；待细胞长至预设时间点时每孔加MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养并吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解，570 nm波长测定各孔光吸收值。

1.2.5 绝对定量PCR检测PEDV基因在细胞中的复制情况 通过Primer 5软件设计病毒及其他基因定量引物，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

检测方法如下：（1）分别在上述引物的5′端加入Nhe I、Xba I酶切位点和保护碱基序列，并用上述引物扩增PEDV中对应基因片段；（2）将所得上述基因片段同源重组至pUC19载体，通过DH5α大肠杆菌扩增质粒，试剂盒提取质粒，并测定质粒浓度，按照“每μL中质粒拷贝数=（质量/分子量）×（6.0×1023）=［质粒浓度（μg/μL）× 1 μL］× 10-6÷［（pUC19载体碱基数+插入片段碱基数）×660］×（6.0×1023拷贝数 /mol）”计算质粒拷贝数（注：每个碱基的平均分子量为330，载体为DNA双链结构）；（3）按照梯度稀释标准品质粒pUC19，通过定量PCR计算基因拷贝数和CT值之间的标准曲线；（4）提取样本中病毒RNA，通过绝对定量PCR检测相关基因在不同处理间拷贝数的差异。

1.2.6 蛋白质检测（Western blot）方法 首先提取细胞或上清样本中蛋白质，并采用BCA Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度（ThermoFisher，美国）。按20-30 μg蛋白质浓度进行Western blot检测。具体步骤如下：（1）样品95℃变性10 min后上样至12% SDS-PAGE胶内，浓缩胶电流90 mA，20 min后转电流110 mA，90 min直至分离胶底部；（2）180 mA，70-150 min恒流中将蛋白转至PVDF膜上（时间视转印蛋白分子大小而定）；（3）TBST 洗涤膜5次，每次5 min 之后，采用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1.5-2 h；（4）将封闭后的PVDF膜置于目的一抗反应液中4℃孵育10-16 h；（5）TBST洗涤膜5次，每次3-5 min后进行室温二抗液中孵育1-2 h；（6）用TBST 洗涤膜5次，每次3-5 min；最后置于发光液中浸泡5 s，并采用Alpha多色荧光和化学发光凝胶成像系统中呈像。所用PEDV N蛋白及CLND 1 蛋白一抗均购自CST（ThermFisher，美国）。

1.2.7 数据统计 所有数据均采用SPSS 17.0进行分析，Duncan法进行多重比较，两两比较采用t-test检验方法。

2 结果

2.1 猪乳exosome抑制PEDV对IPEC-J2细胞活力的影响

2.1.1 细胞表型显微镜观察 显微镜观察结晶紫染色后细胞状态显示，在3种不同处理方式下，对照组细胞呈现空泡状，数量明显减少，且活细胞数量较少（蓝色部分，图1左）；而处理组添加猪乳exosome处理后，各组细胞布满视野，细胞数量和存活率明显高于对照组（蓝色部分，图1右）；提示猪乳exosome能够抑制PEDV病毒对细胞的感染能力，且不受作用方式的影响（即乳外泌体添加顺序）。

图1 结晶紫染色细胞形态学观察Fig. 1 Crystal violet staining and cell morphology observation

2.1.2 结晶紫染色统计 为确定猪乳exosome抑制PEDV对细胞的感染效果，在细胞表型观察结果基础上进一步进行细胞存活数定量分析，结果显示，在IPEC-J2细胞中，猪乳exosome与PEDV处理的3种方式均显著抑制PEDV对细胞的感染，增加细胞存活力（P＜0.05）（图 2）。

图2 细胞存活力统计Fig. 2 Cell survival activity statistics

2.1.3 MTT检测结果 经MTT法检测PEDV对细胞活力的影响，结果（图3）表明在IPEC-J2细胞中，猪乳exosome与PEDV作用的3种处理方式均显著抑制PEDV对细胞活力的影响（P＜0.05），提示猪乳外泌体可增强IPEC-J2细胞活力，抑制PEDV对细胞的感染。

图3 MTT检测细胞活力Fig. 3 Cell activity detected by MTT

2.2 猪乳exosome抑制PEDV在IPEC-J2细胞中的复制

为探索猪乳exosome抑制PEDV对IPEC-J2细胞感染的机理，采用绝对定量分析3种处理方式下，IPEC-J2细胞中PEDV相关基因的表达水平。结果显示，在3种处理方式下猪乳exosome均极显著下调PEDV 病毒 M（图 4-A）、N（图 4-B）、ORF3（图 4-C）、Spike（图 4-D）、RNA polymerase（图 4-E）和 E（图4-F）蛋白等基因在IPEC-J2细胞中的表达量（P＜0.01），提示猪乳exosome可能通过抑制PEDV病毒相关基因在IPEC-J2细胞内表达，从而降低PEDV在细胞内的复制。

图4 猪乳exosome对PEDV相关基因在IPEC-J2细胞内表达的影响Fig. 4 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

2.3 猪乳exosome抑制PEDV在细胞上清中的复制

同样，对各处理组细胞上清中的PEDV病毒相关基因绝对定量结果显示，3种处理方式下，细胞上清中PEDV病毒的M（图5-A）、N（图5-B）、ORF3（图 5-C）、Spike（图 5-D）、RNA polymerase（图5-E）和E蛋白基因（图5-F）的表达量也极显著下调（P＜0.01），提示猪乳exosome还可在细胞外抑制PEDV病毒相关基因表达，减少病毒对IPEC-J2细胞的感染。

图5 猪乳exosome对PEDV相关基因在IPEC-J2细胞上清中表达的影响Fig. 5 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells supernatant

2.4 猪乳exosome抑制IPEC-J2细胞凋亡基因及PEDV N蛋白表达

蛋白表达水平检测PEDV感染的标志性N蛋白及细胞凋亡相关的CLDN1蛋白，结果显示，在3种不同处理方式下，猪乳exosome均明显抑制PEDV N蛋白及IPEC-J2细胞内CLDN1蛋白的表达（图6），推测猪乳exosome可能通过抑制PEDV病毒中N蛋白的表达降低病毒粒子对细胞的感染性，同时降低细胞CLDN1基因表达对细胞凋亡的影响，从而提高细胞活力来抵抗PEDV病毒的入侵。

图6 PEDV病毒及细胞凋亡相关蛋白表达Fig. 6 Expressions of apoptosis-related and PEDV-related proteins

2.5 猪乳exosome对IPEC-J2细胞免疫相关基因表达

对IPEC-J2细胞感染PEDV后免疫相关基因的表达结果（图7）显示，3种处理方式下，猪乳exosome极显著抑制细胞内pAPN基因表达（P＜0.01），而对NF-κB基因的表达无显著影响（P＞0.05）。此外，处理方式1（预防作用）极显著提高IFN-α基因表达（P＜0.01），同时极显著抑制IRF3基因表达（P＜0.01）；而在处理方式2（杀毒作用）和处理方式3（修复作用）作用下，猪乳exosome分别对IFN-α及IRF3基因表达影响不明显（P＞0.05），提示不同作用方式下，猪乳exosome抑制PEDV病毒可能激活的细胞信号通路不同。

图7 猪乳exosome对IPEC-J2细胞免疫相关基因表达的影响Fig. 7 Expressions of immune-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

3 讨论

本文通过3种不同的处理方式探讨了猪乳exosome对PEDV病毒感染仔猪肠道上皮IPEC-J2细胞的作用效果，即预防、杀灭和修复3种作用方式。结果显示，猪乳exosome无论以何种方式添加，对小猪肠道上皮细胞感染PEDV后均有提高细胞存活数量和活力的作用；进一步分析其可能的机理显示，猪乳exosome可直接降低细胞内和细胞上清中PEDV病 毒 M、N、ORF3、Spike、RNA polymerase和 E蛋白相关基因的表达；同时对细胞内增殖凋亡相关的CLDN1蛋白及病毒感染相关的N蛋白具有明显的抑制作用；而对细胞内免疫相关IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表达除处理方式2（杀灭）与3（修复）对IFN-a和IRF3基因的调节作用与其他基因不一致外，其他各处理方式对IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表达调节效果均统一，推测不同作用方式下，猪乳exosome在细胞内抑制PEDV可能激活的信号分子和通路存在差异。

PEDV属于冠状病毒，有囊膜，包含单股正链RNA基因组，病毒的表面由核衣壳蛋白（N），纤突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）构成［13］，复制酶多聚蛋白1ab（ORF1ab）和辅助蛋白（ORF3）是 PEDV 主要的非结构蛋白，它们仅在病毒侵染和复制过程中表达，ORF3是PEDV 中唯一的辅助蛋白，与病毒毒力有关［14-15］。有研究利用异位表达研究发现，E、N 和M 表现出抑制干扰素β（IFN-β）和干扰素调节因子3（IRF3）活性的能力。此外还参与宿主内质网应激和NF-κB 的激活反应［16］。从本研究结果7中显示，感染PEDV病毒的各组NF-κB表达量无明显差异，而处理方式1（预防）和2（杀灭）极显著抑制IRF3的活性，说明猪乳exosome在肠道细胞中预防和杀灭PEDV的过程可能不是通过激活NF-κB及其通路来发挥作用。干扰素调节因子3（IRF-3）和 NF-κB 是诱导 IFN-β 发生转录的两个关键因子，PEDV 感染能激活 NF-κB，但不能激活IRF-3。PEDV 感染能明显抑制 dsRNA 诱导的 IRF-3核转位及 IFN-β的产生［17］。有研究在猪小肠上皮细胞（IECs）上探究PEDV 感染抑制 IRF-3 激活的分子机制显示，IRF-3的上游TANK 结合激酶1（TBK1）或抑制性κB 激酶ε（IKKε）介导的IFN-β的产生并不受 PEDV 感染的影响，而是通过干扰RIG-I 信号通路中的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的活性来抑制 IFN-β的产生实现的［17］，本研究中处理方式1和2中经猪乳exosome处理后，感染PEDV后细胞中IRF-3的表达量显著下调，提示猪乳exosome抑制PEDV感染肠道上皮细胞的调节机制可能与上述研究类似。

棘突蛋白S 是存在于病毒粒子表面的I 型糖蛋白，决定病毒的宿主范围和组织嗜性［18］，病毒入侵细胞时借助于S 蛋白与宿主细胞表面受体结合并通过膜融合的形式进入胞内。有研究表明在PEDV感染的肠细胞中，S 蛋白有削弱宿主I 型干扰素应答的潜能［19］，而I 型干扰素被抑制后，能促进病毒感染［20］，本研究中添加猪乳exosome后，细胞上清中S蛋白的表达量明显降低，提示与宿主表面受体结合的PEDV病毒数量可能明显减少；同时相比对照组细胞内的病毒S蛋白基因也极显著降低，证明猪乳exosome有显著抑制PEDV病毒进入肠道细胞内的作用。病毒侵入时，所有的有核细胞受到刺激会产生 I型干扰素（IFN-I），干扰素的功能多样，不但能提高一些内在蛋白的表达，而且还可以诱导病毒感染细胞凋亡，抵抗病毒感染［21］，研究表明，PEDV可在机体内形成持续性感染来抵抗IFN-I（包括 IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ω 4 种成员）的抗病毒作用［22］。另有研究表明，PEDV感染细胞后可通过降解STAT1影响IFN-α介导的抗病毒作用，从而促进病毒复制［23］。本研究结果显示，处理方式1和3有促进IFN-α表达的效果，推测其可能通过上述类似机制来抵抗病毒入侵，但仍需进一步验证。对比3种处理方式IFN-α表达量可知，在处理方式1中IFN-α表达量极显著升高，提示猪乳exosome可能在预防肠道细胞感染PEDV的过程中效果要优于其他两种方式。

E 蛋白在病毒感染过程中主要定位于内质网，在PEDV 出芽过程中扮演重要的角色［24］。该蛋白能够通过上调宿主葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein 78，GRP78）的表达诱导感染细胞的内质网应激反应，同时激活NF-κB 活性并上调炎症因子IL-8 和抗凋亡分子Bcl-2 的表达［25］。该研究推测E 蛋白通过激活 NF-κB 上调 IL-8 和 Bcl-2 的表达分别促进细胞炎性反应和限制细胞凋亡，维持病毒在细胞中增殖。本研究中E蛋白表达量极显著降低，NF-κB在各处理条件下无影响，而细胞活性升高，证明猪乳exosome能很好的抑制PEDV病毒在细胞内外增殖，提高细胞活力，但其可能的抑制机制并不是通过激活NF-κB来实现的。

膜蛋白M定位于整个宿主细胞中，主要参与病毒粒子的组装和出芽。可诱导宿主产生IFN-α 和特异性抗体，还能介导细胞融合［26］。报道显示，M蛋白能够抑制猪肠道上皮细胞（IEC）周期素A（cyclin A）阻碍肠道上皮细胞生长使其停滞在细胞周期的S期，进而通过干扰细胞周期促进病毒的增殖［26］。在本研究中，经猪乳exosome处理后活细胞数量上升，细胞内M蛋白表达量下降，与上述研究结果类似，说明猪乳外泌体可能通过干预病毒粒子在细胞内的形成过程，从而促进细胞的增殖及活性。而定位于宿主细胞质中，且参与病毒基因组转录和合成、病毒粒子组装以及宿主应激和免疫反应的N蛋白［17］在本研究中表达量也显著下调，更进步证明，猪乳exosome有抑制PEDV病毒在细胞内形成的作用。

ORF3 是PEDV 唯一的辅助蛋白，可与S 蛋白相互作用调节病毒复制［27］，与病毒的毒力强弱和复制密切相关。同时与结构蛋白M 和N 相似，也表现出调控宿主细胞周期的能力。Ye 等［28］利用构建稳定表达ORF3 蛋白的Vero 细胞证实，ORF3 通过延长细胞周期的S 期和促进囊泡形成的方式以利于病毒增殖，同时相比强毒株的PEDV，稳定表达ORF3的Vero 细胞更利于弱毒株的增殖。此外，ORF3 还具有抑制PEDV 诱导的细胞凋亡功能而促进病毒的复制［29］。本研究结果显示，经猪乳exosome处理后ORF3表达量下调，细胞活力明显增强，进一步证明猪乳exosome有抑制病毒复制的能力。

多项报道显示，pAPN为PEDV感染的功能性受体，PEDV利用pAPN作为主要的受体进入细胞［30-32］，本研究结果显示，添加猪exosome后pAPN表达量极显著降低，提示猪乳exosome可能通过作用于肠道细胞的功能性受体，从而阻止病毒进入并感染细胞。

CLDN1是细胞紧密连接蛋白claudin家族的一个成员，也是构成紧密连接结构TJs的一个组分。研究表明，CLDN1在体内外可以通过激发自噬促进食管鳞状细胞癌ESCC细胞的增殖和迁移［33］。同时研究也表明，敲低CLDN1将直接导致肝癌细胞的增殖和迁移能力下调［34］，而在APCmin小鼠中过表达CLDN1能显著促进结肠癌的生长和大小（4倍），并降低小鼠的存活率［35］。CLDN1在胃癌病变中显著上调，其表达率的高低与术后存活率密切相关［36］。由此可见，CLDN1与细胞癌变和活性密切相关，本研究显示在经PEDV处理细胞后，细胞形态脱落严重，活力降低，CLDN1蛋白表达上调，而经猪乳exosome处理后，以上结果均有缓解，表明猪乳exosome能抑制肠道细胞跨膜蛋白CLDN1的表达，从而增强细胞的抗感染能力，进而提高细胞活性。

4 结论

猪乳exosome能抑制PEDV病毒对肠道上皮IPEC-J2细胞的入侵能力，其可能的机制为：一方面通过直接抑制PEDV病毒感染相关的基因和蛋白的表达发挥作用，另一方面可能是通过调节肠道细胞本身关键受体基因或免疫相关基因表达发挥作用，或通过两种作用机制协同从而达到降低PEDV感染力，提高肠道细胞的活力，实现猪乳exosome对肠道细胞的保护作用。