小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的酶活调控

孟晓建 于建东 郑小梅，4 郑平，4 李志敏 孙际宾，4叶勤

（1. 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；2. 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308；3. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；4. 国家合成生物技术创新中心，天津 300308）

柠檬酸是当前世界上产量和消费量最大的有机酸，广泛用于食品饮料、医药化工和有机材料等领域［1］。目前，柠檬酸的全球年产量达到200万t以上，并以每年3.5%-4.0%的速度增加［2］。黑曲霉是柠檬酸的主力生产菌株，具有极端耐酸性，能够在pH低至1.5下正常生长发酵，具有强鲁棒性，可快速利用工业粗原料大量积累柠檬酸［1］。黑曲霉独特的柠檬酸合成与积累能力表明其具有一套独特的代谢调控机制。目前已有许多相关研究致力于黑曲霉柠檬酸代谢中的关键调控作用，以期揭示黑曲霉高产柠檬酸的机理［1，3-4］。黑曲霉柠檬酸合成代谢主要是六碳糖经过糖酵解或者磷酸戊糖途径转化为磷酸烯醇式丙酮酸进而降解为丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。在大多数生物体中，柠檬酸合成后会进一步代谢生成其他物质供生物体利用，不会过量积累。但黑曲霉柠檬酸合成代谢中存在一系列受调控的关键酶，有效地保障了糖酵解途径的畅通，同时阻断了三羧酸循环中的柠檬酸下游降解，使得柠檬酸得以大量积累。其中，糖酵解途径的调节是黑曲霉柠檬酸积累的重要调控机制［5］。

在糖酵解途径中，己糖激酶、磷酸果糖激酶与丙酮酸激酶是3个重要的关键酶。在多数生物中，磷酸果糖激酶是控制糖酵解代谢流量的关键酶，会受柠檬酸的反馈抑制，因此黑曲霉的磷酸果糖激酶的调控也备受关注。黑曲霉磷酸果糖激酶PfkA被高浓度的ATP、Mn2+与柠檬酸所抑制，但被NH4+、Zn2+、Mg2+与果糖 -2，6-二磷酸所激活［6-7］。但相对而言，目前对己糖激酶与丙酮酸激酶的代谢调控研究相对较少。在黑曲霉己糖激酶方面，Panneman等［8］发现黑曲霉已糖激酶受到海藻糖-6-磷酸的抑制，但Arisan-Atac等［9］发现海藻糖-6-磷酸对黑曲霉已糖激酶的调控作用较弱，尤其是在柠檬酸发酵过程中细胞内的海藻糖-6-磷酸水平较低（46 μmol/g dw），当敲除海藻糖-6-磷酸合酶后，对柠檬酸发酵水平影响较小。在黑曲霉丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素色谱和凝胶过滤纯化了黑曲霉天然丙酮酸激酶，发现果糖-1，6-二磷酸可阻止纯化过程中丙酮酸激酶的酶活降低，但对新纯化的丙酮酸激酶无显著影响而ATP有微弱的激活作用；当丙酮酸激酶纯化后的样品储存3 d，其活性则可被果糖-1，6-二磷酸激活，被ATP抑制。这些研究多以黑曲霉天然已糖激酶与丙酮酸激酶为研究对象，检测小分子代谢物对其表观酶活的影响，可能存在内源同工酶或小分子代谢物修饰带来的干扰。

为加深对己糖激酶与丙酮酸激酶的代谢调控认识，本研究系统检测了中心代谢中的小分子代谢物对己糖激酶与丙酮酸激酶的调控，鉴定出其酶活的关键效应物。然后，进一步利用同源建模获得黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的三维蛋白结构，利用分子成键分析对关键效应物与己糖激酶与丙酮酸激酶的相互作用进行计算机模拟，预测出黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的别构调控位点，旨为后续黑曲霉代谢工程改造奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 FastPfu DNA聚合酶与限制性内切酶购自北京全式金生物技术有限公司。ClonExpress®II一步重组基因克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。GST-BindTM亲和层析树脂购自Merck公司（美国）。果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F6P）、果糖 -1，6-二磷酸（fructose-1，6-bisphosphate，FBP）、丙酮酸（pyruvate）、磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）、草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）、柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸、α-酮 戊 二 酸（α-Oxoglutarate，AKG）、ADP、ATP、NADP+、乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、来源于木霉的裂解酶均购自Sigma公司（美国）。

1.1.2 菌株、质粒与引物 本研究所使用的所有菌株和质粒均在本实验室保存。大肠杆菌Escherichia coli Trans1-T1 菌株购自北京全式金生物技术有限公司，用于重组表达质粒的构建。黑曲霉A. niger G1与质粒pGm-GST用于己糖激酶与丙酮酸激酶的表达。本研究所用的引物如表1所示。

表1 本研究所用的菌株、质粒与引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重组表达质粒pGm-GST-HxkA与pGm-GSTPkiA的构建 从Genbank基因数据库中获得己糖激酶HxkA与丙酮酸激酶PkiA的核苷酸序列，设计用于质粒构建的引物（表1）。然后以高产柠檬酸黑曲霉菌株的基因组为模板，分别以HxkA-F/HxkA-R与PkiA-F/PkiA-R为引物扩增己糖激酶与丙酮酸激酶的基因片段。经核酸琼脂糖电泳检测后，进行PCR产物纯化，再与经限制性内切酶XbaⅠ处理的质粒pGm-GST利用ClonExpress® II一步重组基因克隆试剂盒进行目的片段与质粒载体的重组，然后热击转化到大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞。利用菌落PCR与重组表达质粒的酶切验证来筛选阳性克隆，并送金唯智测序验证，得到重组表达质粒pGm-GSTHxkA与pGm-GST-PkiA。

1.2.2 黑曲霉重组表达菌株的构建 利用PEG介导的原生质体DNA转化方法将重组表达质粒pGm-GST-HxkA与pGm-GST-PkiA转化至黑曲霉G1菌株的原生质体中。黑曲霉DNA转化方法参考文献［11］，首先，进行原生质体悬液的制备：将G1菌株的孢子悬液在30℃、200 r/min 培养16-18 h。然后采用含有1.0%（W/V）来源于木霉的裂解酶的酶解体系，在37℃孵育2-3 h，裂解菌体的细胞壁以制备原生质体。用STC进行洗涤后，获得原生质体悬液。然后，在100 μL原生质体中分别加入2 μg重组表达质粒pGm-GST-HxkA与pGm-GST-PkiA以及25% PEG缓冲液，冰浴后依次加入1 mL 25% PEG缓冲液，加入2 mL STC 和10 mL预热的MMSA上层培养基，然后平铺至MMSA下层培养基上，在30℃倒置培养5 d。挑取转化子在CMA固体平板上进行单孢子划线分纯，以获得稳定遗传的转化子。然后，采用天根植物基因组提取试剂盒来提取各转化子的基因组。最后，以各转化子基因组为模板，以GV-F/GV-R为引物，来筛选阳性黑曲霉重组菌株。

1.2.3 黑曲霉重组酶的表达与纯化 将阳性黑曲霉重组菌株的孢子悬液接种到100 mL蛋白发酵培养基，在30℃下200 r/min培养4 d。过滤收集菌体后，用液氮将菌体研磨成粉，然后再加10 mL的PBS蛋白提取液，涡旋振荡。然后8 000 r/min，4℃离心10 min收集上清，即为蛋白粗提液。

采用GST·BindTM树脂来对各重组蛋白进行亲和层析纯化。首先，用10 mL GST 洗涤缓冲液1.5 g/L Na2HPO4·12H2O，0.2 g/L KH2PO4，8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl来平衡GST·BindTM树脂。然后，向亲和层析柱中加入含有重组蛋白的蛋白粗提液，再用GST洗涤液进行洗涤未结合的蛋白，然后再用含有不同浓度的谷胱甘肽蛋白洗脱液进行洗脱，最后，将洗脱液用10 kD超滤管中超滤。将纯化后的蛋白样品进行12% SDS-PAGE蛋白电泳检测与Pierce®BCA蛋白浓度定量检测。

1.2.4 不同小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶酶活的影响 己糖激酶酶活检测方法参照文献［12-13］。标准反应体系为50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ATP，0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L葡萄糖，3.5 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶。首先，30℃孵育5 min后，加入适量的己糖激酶重组酶，酶标仪340 nm下检测反应体系中生成的NADH的吸光值。一单位己糖激酶的酶活力定义为30℃反应条件下，反应体系中每分钟生成1 μmol NADPH所需的酶量。

丙酮酸激酶酶活力检测方法参考文献［12］。标准反应体系为 50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ADP，0.2 mmol/L NADH，1 mmol/L PEP，14 U 乳酸脱氢酶。首先，30℃孵育5 min后，加入适量的丙酮酸激酶重组酶，酶标仪340 nm下检测反应体系中消耗的NADH的吸光值。一单位丙酮酸激酶的酶活力定义为30℃反应条件下，反应体系中每分钟消耗1 μmol NADH所需的酶量。

为检测不同小分子代谢物对重组己糖激酶与丙酮酸激酶的酶活力的影响，在标准反应体系中添加不同浓度的小分子代谢物，然后检测残留酶活。小分子代谢物具体包括磷酸-6-果糖、1，6-二磷酸果糖、丙酮酸、PEP、草酰乙酸、柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、富马酸、ADP与ATP。检测数据采用t-检验进行进行显著性检验：与对照相比，当P＜0.05时则表明样本与对照存在显著差异，当P＜0.01时则表明样本与对照存在较为显著差异。

1.2.5 黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的同源建模与小分子代谢物的分子对接 首先，以来源于乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的己糖激酶的晶体结构［13］（PDB ID：3O4W）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的丙酮酸激酶的晶体结构［14］（PDB ID：1A3W）为模板，利用YASARA软件［15］分别对黑曲霉的己糖激酶HxkA与丙酮酸激酶PkiA进行同源建模。利用在线分析软件ESPript3.0［16］（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）进行基于蛋白结构信息的多序列比对分析。然后，利用ChemBiodraw软件与ChemBio3D软件绘制小分子代谢物的立体结构，然后在YASARA软件中分别与己糖激酶HxkA与丙酮酸激酶PkiA进行分子对接与成键分析。

2 结果

2.1 己糖激酶与丙酮酸激酶黑曲霉表达菌株的构建

为揭示小分子代谢物对己糖激酶与丙酮酸激酶的代谢调控，将高产柠檬酸黑曲霉的己糖激酶与丙酮酸激酶在黑曲霉蛋白表达菌株G1中进行内源重组表达。首先，利用PCR扩增获得高产柠檬酸黑曲霉的己糖激酶基因HxkA与丙酮酸激酶编码基因PkiA。PCR结果如图1-A所示，HxkA基因与PkiA基因的DNA序列理论大小分别为1 798 bp与2 052 bp，PCR扩增结果与理论大小相一致。然后，用ClonExpress® II试剂盒成功将各基因分别重组至GST融合表达表达质粒pGm-GST，成功构建了各重组表达质粒pGm-GST-HxkA和pGm-GST-PkiA（图1）。将各重组表达质粒转入黑曲霉G1菌株的原生质体中，挑取5个转化子来进行基因组提取后，采用GV-F与GV-R为引物来筛选阳性转化子。HxkA基因与PkiA基因的GST融合蛋白重组表达菌株的PCR验证产物的理论大小分别为3 052 bp与3 322 bp，如图1-B所示，AnG1-HxkA1-AnG1-HxkA5与AnG1-PkiA1-AnG1-PkiA5分别为黑曲霉重组表达菌株，选取AnG1-HxkA1与AnG1-PkiA1来进行重组蛋白的表达。

图1 己糖激酶与丙酮酸激酶黑曲霉重组表达菌株构建的PCR扩增电泳图Fig. 1 Electrophoretogram of PCR products used for the construction of hexokinase（HxkA）and pyruvate kinase（PkiA）expressed A. niger strains

2.2 黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的表达与纯化

为检测己糖激酶HxkA基因与丙酮酸激酶PkiA基因能否正确表达，对黑曲霉表达菌株AnG1-HxkA1与AnG1-PkiA1进行蛋白发酵检测。如图2所示，重组GST融合蛋白在蛋白发酵终点出现显著积累，HxkA基因与PkiA基因的编码序列（cDNA序列）理论大小分别为1 473 bp与1 581 bp，各自蛋白的理论大小分别为54 kD与58 kD，因而GST-HxkA与GST-PkiA融合蛋白的理论大小分别为80 kD与84 kD，如图2所示GST融合蛋白与理论大小相一致，这表明重组GST融合蛋白GST-HxkA与GST-PkiA在黑曲霉中成功表达。

为获得重组GST融合蛋白，采用GST·BindTM树脂来对各重组GST融合蛋白进行亲和层析纯化，如图2所示，分别获得纯化的重组GST融合蛋白。对纯化的重组GST融合蛋白进行酶活测定，发现GST-HxkA与GST-PkiA的比酶活分别为（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg。

图2 己糖激酶与丙酮酸激酶GST融合蛋白亲和层析纯化前后的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE of the recombinant GST-fused HxkA and PkiA proteins before and after protein purification by affinity chromatography

2.3 不同小分子代谢物对己糖激酶与丙酮酸激酶酶活的影响

为研究小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶酶活的影响，首先检测了在1 mmol/L 小分子代谢物条件下HxkA与PkiA酶活的变化。结果如图3所示，HxkA受4种小分子代谢物的抑制，两种小分子代谢物的激活。在果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP存在时，HxkA酶活受到显著的抑制，残留酶活分别为81.75%±1.67%、71.97%±0.95%、75.60%±1.88%与50.89%±2.78%。在草酰乙酸和异柠檬酸存在时，HxkA酶活受到一定的激活，残留酶活分别为112.30%±1.14%与109.34%±1.04%。而PkiA受3种小分子代谢物的抑制与一种小分子代谢物的激活。在果糖-1，6-二磷酸、苹果酸和富马酸存在时，PkiA酶活受到显著的抑制，残留酶 活 分 别 为56.51%±1.04%、88.45%±3.09%与83.54%±2.47%。仅在ADP存在时，PkiA酶活受到显著的激活，残留酶活提高至179.36%±3.47%。

图3 小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶（A）与丙酮酸激酶酶活（B）影响的检测结果Fig. 3 Effects of metabolites on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

为进一步验证小分子代谢物对己糖激酶与丙酮酸激酶酶活的影响，检测了不同浓度小分子代谢物存在时HxkA与PkiA酶活的变化。由于在柠檬酸生产菌株中，柠檬酸的生理浓度为1-5 mmol/L［3］，每摩尔柠檬酸净生成等摩尔的ATP，由此借鉴，本文检测了0、0.5、2.5、5、7.5、10 mmol/L的小分子代谢物对HxkA与PkiA酶活的影响。结果如图4所示，不同浓度的果糖-6-磷酸、异柠檬酸与草酰乙酸对HxkA酶活影响幅度相对较小，而不同浓度的PEP、ATP与ADP对HxkA酶活的影响显著。随PEP、ATP与ADP浓度的提高，HxkA酶活显著下降。在2.5 mmol/L浓度的PEP、ATP与ADP下，HxkA残留酶活分别为66.67%±1.28%（P=0.014）、5.49%±0.47%（P=0.003）与41.74%±0.97%（P=0.011）；在10 mmol/L浓度的PEP、ATP与ADP下，HxkA残留酶活分别为0.85%±0.42%（P=0.003）、0.08%±0.02%（P=0.000 1）与23.33%±0.03%（P=0.000 2）。对于PkiA而言，不同浓度的ADP对PkiA酶活具有显著的激活作用，在2.5 mmol/L下，酶活提高1.38倍（P=0.039）；至5 mmol/L时，PkiA酶活提高1.55倍（P=8.7E-05）；但浓度进一步提高时，PkiA酶活提高幅度则出现下降。而3种抑制小分子代谢物则随浓度的提高对PkiA的抑制效果逐渐增强。在2.5 mmol/L浓度的果糖-1，6-磷酸、苹果酸和富马酸下，PkiA残留酶活分别为97.21%±1.08%、89.30%±1.55%与81.24%±0.31%；在10 mmol/L浓度的果糖-1，6-磷酸、苹果酸和富马酸下，PkiA残留酶活分别为84.19%±1.09%、83.72%±1.46%与73.64%±3.21%。

图4 不同浓度的关键小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶（A）与丙酮酸激酶酶活（B）影响的检测结果Fig.4 Effects of key metabolites under different concentrations on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

2.4 关键小分子代谢物与己糖激酶与丙酮酸激酶的互作模拟分析

为揭示关键小分子代谢物对己糖激酶和丙酮酸激酶的作用机制，首先利用同源建模模拟HxkA和PkiA的三维结构。首先，通过在蛋白结构数据库PDB中进行蛋白序列比对来选取同源建模的蛋白结构模板。结果发现，HxkA和K. lactis来源的己糖激酶KlHxkA的蛋白同源性最高，序列相似性为27.6%；PkiA和S. cerevisiae 来源的丙酮酸激酶ScPkiA的蛋白同源性最高，序列相似性为34.0%（图5）。因此，分别以KlHxkA（PBD ID：3O4W）与ScPkiA（PBD ID：1A3W）的晶体结构为模板，利用同源建模获得HxkA和PkiA的三维蛋白结构（图6）。具体来看，如图6所示，HxkA为同源二聚体，而PkiA为同源四聚体。具体而言，HxkA各亚基中分别包括小的头部结构域（head-domain）与大的尾部结构域（tail-domain），并两个亚基以“头-尾”相连的方式形成对称的同源二聚体，HxkA的底物葡萄糖结合位点分别为Asn210、Asp211、Thr212、Gly235、Glu266与Glu299（图5）。黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的各亚基中具有A-结构域（TIM-barrel）、B-结构域（lid-domain）与C-结构域（allosteric-domain）3个结构域，活性位点分别为Arg63、Asn65、Asp98、Phe228、Lys254、Glu256、Asp280与 Thr325，位于A-结构域与B-结构域之间（图5、图6），PkiA四个亚基分别以A/A′与C/C′的方式形成同源四聚体。

图5 黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的多序列比对结果Fig.5 Multiple sequence alignment of HxkA and PkiA from A. niger

图6 基于同源建模的黑曲霉己糖激酶（A）与丙酮酸激酶（B）三维结构模拟结果Fig.6 Simulated 3D structure results of HxkA（A）and PkiA（B）from A. niger based on homologous modeling

为进一步解析关键小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的相互作用，利用YASARA软件对关键小分子代谢物与HxkA和PkiA进行分子对接与成键分析。如图7所示，黑曲霉己糖激酶HxkA与具有抑制关键小分子代谢物果糖-6-磷酸、PEP、ATP与ADP的互作位点均位于底物葡萄糖结合口袋附近，并且具有较强抑制活性的PEP、ATP与ADP都与关键底物结合位点Asn210形成氢键。具体而言，ADP与关键底物结合位点Asn210形成一个氢键，PEP与ATP则分别与该位点形成2个与3个氢键，而具有较弱抑制作用的果糖-6-磷酸则未与该位点形成氢键，这表明Asn210与关键小分子代谢物的结合强弱可能参与关键小分子代谢物对HxkA酶活的抑制程度。果糖-6-磷酸与HxkA的Asn66 和Asn264形成氢键；PEP与HxkA的Asn66、Ala161、Asn210和Asn264形成氢键；ADP与HxkA的Ala161、Asn210和Asn264形成氢键。由此推测，位于底物结合口袋附近的Asn66、Ala161和Asn264也可能是参与别构调控的重要位点。与果糖-6-磷酸、PEP与ADP的互作位点方向不同，ATP则与HxkA的Thr175、Lys176、Asn210和Asn237形成氢键，也表明底物结合口袋另一侧的Thr175、Lys176与Asn237也可能是参与别构调控的重要位点。

图7 己糖激酶HxkA与关键小分子代谢物的分子对接模拟结果Fig.7 Molecular docking simulation of HxkA with key metabolites

丙酮酸激酶催化PEP与ADP生成丙酮酸与ATP。如上文所述，底物ADP对PkiA的活性具有显著的前馈激活作用，而果糖-1，6-磷酸、苹果酸和富马酸则具有一定的抑制作用。如图8所示，底物ADP与抑制关键小分子代谢物分别结合于不同的结构域。ADP与PkiA的结合位点位于A-结构域与B-结构域之间的催化活性位点附近，分别与Asn65、His68、Asp161、Gln313和Glu316形成氢键。而果糖-1，6-二磷酸、苹果酸和富马酸这些关键小分子代谢物则结合于别构效应结构域C-结构域。具体来看，果糖-1，6-磷酸与PkiA的 Thr416、Thr417、Ser418、Arg477、Trp470和Gly508各形成一个氢键；苹果酸分别与Thr416和Thr417形成一个和两个氢键；富马酸也分别与Thr417、Trp470和Gly502形成一个氢键。

图8 丙酮酸激酶PkiA与关键小分子代谢物的分子对接模拟结果Fig.8 Molecular docking simulation of PkiA and key metabolites

3 讨论

黑曲霉是柠檬酸的主力生产菌株，可快速转化粗放的淀粉等碳源大量积累柠檬酸［1，3］。黑曲霉的中心代谢尤其是糖酵解途径具有独特的代谢调控机制以实现柠檬酸的不断合成与分泌［1，3-4］。糖酵解途径存在由己糖激酶、磷酸果糖激酶与丙酮酸激酶催化3个不可逆反应，成为调控糖酵解途径的主要靶点。黑曲霉中磷酸果糖激酶受高浓度的ATP与柠檬酸的抑制，但这种抑制可通过体内的2，6-二磷酸果糖与NH4+的激活作用而解除。目前在黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的代谢调控研究相对较少。虽然有文献报道黑曲霉己糖激酶受体内海藻糖-6-磷酸的抑制［8］，但仅在柠檬酸发酵初期检测到较低水平的海藻糖-6-磷酸，推测这种调控作用相对较小［9］。在丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］检测发现果糖-1，6-二磷酸可能对黑曲霉直接纯化丙酮酸激酶的有一定的激活作用，但这一结果会受蛋白纯化与储存时间的影响。为加深对这两个关键酶的代谢调控的认识，本文系统检测13种中心代谢途径中的小分子代谢物对其酶活的影响，结果发现己糖激酶的酶活受高浓度PEP、ATP与ADP的显著抑制，而丙酮酸激酶的酶活则被果糖-1，6-二磷酸、苹果酸和富马酸的小幅度抑制，被底物ADP显著激活。

在细胞工厂的代谢改造中，对于糖酵解途径的改造，除加强关键酶的表达来提高代谢通量［17］外，解除小分子代谢物对关键酶的抑制是较为重要的改造策略［18］。这一策略中小分子代谢物与关键酶的互作位点的发现是首要步骤。对于尚无蛋白晶体结构的关键酶来说，蛋白结构的同源建模与分子对接成为有效的分析手段来推测参与关键小分子代谢物互作的关键氨基酸位点。本文首先利用同源建模模拟获得了HxkA和PkiA的三维结构，然后利用YASARA软件进行分子对接与成键分析，为解析关键小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的相互作用与调控机制提供参考。通过蛋白结构模拟与成键分析，发现黑曲霉己糖激酶HxkA的具有抑制关键小分子代谢物果糖-6-磷酸、PEP、ATP与ADP的互作位点均位于底物葡萄糖结合口袋附近，并且具有较强抑制活性的PEP、ATP与ADP都与关键底物结合位点Asn210形成氢键。黑曲霉HxkA的 Asn210 与 K. lactis来 源 的 KlHxk1 的 Asn209［14］相对应，是底物葡萄糖的重要结合位点。KlHxk1存在开放构象（open-state）与闭合构象（closedstate）这两种构象。在开放构象中，葡萄糖分子与Asn209，Asp210，Thr211，Glu268与Glu301的侧链以及Gly234的主链形成氢键，在闭合构象中，位于KlHxk1小亚基两个loop上的Thr174与Lys175会进一步与葡萄糖形成氢键［14］。本文预测发现果糖-6-磷酸、PEP与ADP结合于HxkA的底物结合口袋附近的Asn66、Asn210、Ala161和Asn264，而ATP则与Thr175、Lys176、Asn210和Asn237 形成氢键。通过与KlHxk1的氨基酸比对分析推测，ATP可能通过影响闭合构象中葡萄糖与Thr175、Lys176氢键的形成而抑制HxkA的功能。

丙酮酸激酶是糖酵解途径中最后一步反应，催化PEP与ADP生成丙酮酸与ATP［12］。丙酮酸激酶的结构相对复杂为同源四聚体，每个单体有3个结构域，存在较为典型的别构调控，当与激活剂结合时，会从较为紧实无活性的构象（T-state）转变为较为松散的有活性的构象（R-state），当与抑制剂合时则发逆向的别构变化［15，19-21］。Jurica 等［15］发现酵母丙酮酸激酶YPK受果糖-1，6-二磷酸的别构激活，YPK中果糖-1，6-二磷酸的结合位点位于C结构域内部的 Ser402、Ser404、Thr407、Asp455、Arg459与Trp452，结合前后的lys446到Trp452位的loop区域与Ala487到Asn493的转角区域的变化而进一步导致YPK构象变化［15］。本文发现果糖-1，6-二磷酸对黑曲霉丙酮酸激酶PkiA则具有小幅的抑制作用，但互作位点类似，Thr416、Thr417、Ser418与果糖-1，6-二磷酸的磷酸基团形成氢键，Trp470与果糖-1，6-二磷酸的呋喃糖基团形成氢键，推测果糖-1，6-二磷酸等关键小分子代谢物的结合也可能导致β17与α17之间从Glu460到Trp470的柔性loop区域以及β18与β19之间从Gly505到Asn511的转角区域的构象协同变化。此外，苹果酸分别与Thr416和Thr417形成一个和两个氢键；富马酸也分别与Thr417、Trp470和Gly502形成一个氢键。由此推测，黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的Thr416、Thr417与Trp470可能是参与别构调控的重要结合位点。本文细致分析中心代谢中的小分子代谢物对黑曲霉己糖激酶与丙酮酸激酶的酶活影响并预测了其调控位点，为黑曲霉细胞工厂的代谢调控改造提供借鉴。

4 结论

本文构建了黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的过表达菌株，利用GST亲和层析进行重组蛋白的纯化，获得比酶活分别为（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg的己糖激酶和丙酮酸激酶。通过中心代谢途径中的小分子代谢物对重组蛋白的酶活影响检测，发现果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP对黑曲霉己糖激酶存在抑制作用，果糖-1，6-二磷酸、苹果酸和富马酸对丙酮酸激酶有抑制作用，而ADP对黑曲霉丙酮酸激酶具有显著激活作用。利用蛋白三维结构同源建模及蛋白与小分子代谢物互作的成键分析，发现己糖激酶底物口袋的Asn210位点及其附近氨基酸可能为参与别构调控的关键氨基酸，丙酮酸激酶别构结构域的Thr416、Thr417与Trp470参与别构调控小分子代谢物的互作。

致谢

衷心感谢赵晶老师与谭子瑊在蛋白结构模拟与分子对接分析上给予的帮助，衷心感谢德国柏林理工大学Dr. Timothy C. Cairns对英文摘要的修改与润色。