被α-synuclein激活的小胶质细胞通过外泌体转运miR-19a-3p抑制神经细胞自噬

林 辉，刘思齐，黄云苑，周天恩

（1.华南农业大学医院内科，广东广州 510640；2.中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东广州 510120；3.中山大学附属佛山医院急诊科，广东佛山，528000）

过表达的α-突触蛋白（α-synuclein，SNCA）以及其在多巴胺能神经元中的聚集、沉积是帕金森病（Parkinson's disease，PD）发病机制中的重要因素。我们之前研究发现［1］，过表达SNCA 的神经细胞外泌体可被小胶质细胞摄取，并通过miRNA-19a-3p调控PTEN 通路，进而抑制受体小胶质细胞自噬。然而小胶质细胞自噬被抑制后重新分泌的外泌体的miRNAs 成分及功能变化尚不清楚。我们研究发现，小胶质细胞自噬被抑制后重新分泌的外泌体也可以再次被神经细胞摄取，然而这部分外泌体对神经元自噬功能的影响亦不清楚。本文主要研究了被过表达SNCA 的SH-SY5Y 细胞外泌体刺激后的小胶质细胞重新分泌的外泌体（SNCA-HM Exo）的miRNAs 成分变化，以及其对受体神经细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y 细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司），人小胶质细胞（Human microglia，HM，上海斯信生物科技有限公司），LC3抗体（美国CST 公司），P62 抗体（日本mbl 公司），GAPDH 抗体（美国Abcam 公司），HRP 标记羊抗兔二抗（美国Abcam 公司），HRP 标记羊抗鼠二抗（美国Abcam 公司），M-MLV 逆转录酶（美国Promega公司），GoTaq®qPCR Master Mix（美国Promega 公司），miRCURYTM Array microarray kit（丹麦Exiqon公司），Hybridization Chamber II（美国Corning 公司），BioarrayLifterSlip coverslip（美 国Ambion 公司），miRCURYTM Array Labelling kit（丹麦Exiqon公司），RNeasy Mini Kit（德国Qiagen 公司），PTEN抗体（美国Abcam公司），Akt抗体（美国CST公司），p-Akt 抗体（美国Santa Cruz 公司），mTOR 抗体（美国Abcam 公司），p-mTOR 抗体（美国Santa Cruz 公司），hsa-miR-19a-3p mimic（广州市锐博生物科技有限公司），hsa-miR-19a-3p inhibitor（广州市锐博生物科技有限公司）。

1.2 小胶质细胞培养及外泌体分离

复苏并培养小胶质细胞（human microglia，HM），以1×106细胞数接种于10 cm 培养皿中，先培养24 h。分为两组，Con-Exo HM 组：在HM 中加入过表达GFP-con 的SH-SY5Y 细胞外泌体（约1×108微粒数）；SNCA-Exo HM 组：在HM 中加入过表达GFP-SNCA 的SH-SY5Y 细胞外泌体（约1×108微粒数），培养24 h后换培养液，继续培养24 h后收集上清液，采用超速梯度离心的方法分离外泌体，具体离心方法详见我们既往发表的文章［2］。Con-Exo HM 分泌的外泌体简称为Con-HM Exo，SNCA-Exo HM 分泌的外泌体简称为SNCA-HM Exo。收集分离的外泌体送NTA 分析，结果显示Con-HM Exo 粒子浓度为0.923×108（particles/mL），SNCA-HM Exo粒子浓度为0.873×108（particles/mL）。

1.3 小胶质细胞外泌体负染色后电镜鉴定

滴加20 μL 外泌体悬液于载样铜网上，在室温条件下静置1 min，用滤纸从背面吸干液体，滴加2%磷钨酸溶液（pH 6.8）20 μL 于铜网上，室温下负染色1 min。用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烘干10 min，置于于200 kv透射电镜下观察。

1.4 外泌体miRNAs芯片分析

外泌体超速离心收集后，加0.25 mL TRIZOL充分裂解，加入氯仿两相分离，收集水相，加入异丙醇沉淀RNA，乙醇清洗。RNA 质量检测后应用NanoDrop®ND-1000 进行RNA 浓度和纯度检测。应用miRCURYTM Array Labelling kit 进行miRNAs标记。采用RNeasy Mini Kit 浓缩RNA，之后应用miRCURYTM Array microarray kit 进 行miRNAs 芯片杂交。最后使用Genepix 4000B 扫描芯片图像，并采用Genepix Pro 6.0软件分析。

1.5 miR-19a-3p 模拟物（miR-19a-3p mimic）及抑制剂（miR-19a-3p inhibitor）转染SH-SY5Y细胞

在每个6孔板中接种1×105SH-SY5Y细胞，培养24 h。转染前换液，每孔加入培养液2 mL，miR-19a-3p 模拟物及抑制剂的转染浓度均为100 nmol/L。分别用120 μL 1×Buffer 稀释10 μL 20 μmol/L 的miR-19a-3p 模拟物及抑制剂，摇匀后分别加入12 μL Reagent 混匀，在室温条件下孵育10 min 后分别加入每孔含2 mL 培养液的6 孔板中。共同培养48 h 后收集细胞，采用PCR 方法验证转染的效率。

1.6 实验分组

每个6 孔板中接种1×105SH-SY5Y 细胞，分为4组，具体如下：

Con-HM Exo 组：Con-HM Exo（约1×108微粒数）与SH-SY5Y细胞共培养48 h。

Con-HM Exo+miR-19a mimic 组：miR-19a-3p模拟物转染SH-SY5Y 细胞后，加入Con-HM Exo（约1×108微粒数）共培养48 h。

SNCA-HM Exo 组：SNCA-HM Exo（约1×108微粒数）与SH-SY5Y细胞共培养48 h。

SNCA-HM Exo+miR-19a-3p inhibitor 组：miR-19a-3p inhibitor 转染SH-SY5Y 细胞后，加入SN⁃CA-HM Exo（约1×108微粒数）共培养48 h。

1.7 Western Blot检测蛋白的表达水平

收集SH-SY5Y 细胞，提取蛋白后采用凝胶电泳方法检测目的蛋白表达。蛋白电泳结束后将蛋白转至PVDF 膜上，然后封闭非特异性抗原，之后加入相应的一抗P62（MBL，PM045，1∶1 000），LC3（CST，CST3862，1∶1 000），PTEN（Abcam，ab32199，1：1 000），p-Akt（Santa Cruz，sc-81433，1∶1 000），Akt（CST，#9272，1∶1 000），p-mTOR（Santa Cruz，sc-101738，1∶1 000），mTOR（Abcam，ab2732，1∶1 000），4 ℃条件下震荡孵育，第2 天采用TBST 洗涤后分别加入羊抗鼠二抗（Abcam，ab6808，1∶5 000）或羊抗兔二抗（CST，#7054，1∶5 000），继续在室温条件下震荡孵育50 min后TBST洗涤三次，最后加入显影剂曝光显影。采用Image J 软件分析蛋白条带的光密度值。以GAPDH（Ab⁃cam，ab70699，1∶5 000）作为内参，比较各组细胞蛋白表达的差异。

1.8 统计学方法

所有数据均采用SPSS13.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的定量数据用±s表示，两个独立样本定量数据的比较采用t检验，多组间定量数据的比较采用单因素方差分析，方差分析有统计学意义时多重比较采用LSD-t检验，当方差不齐时，采用Kruskal WallisH检验。差异有统计学意义时采用Bonferroni 法进行两两比较。当P<0.05 时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小胶质细胞外泌体透视电镜鉴定

小胶质细胞外泌体负染色后，透视电镜下可见直径大约40～100 nm 的囊泡，其大小及形状特征与外泌体相符（图1）。

图1 小胶质细胞外泌体透视电镜鉴定Fig.1 Identification of microglia exosomes by electron microscope

2.2 不同组别之间外泌体存在差异表达的miRNAs

为研究被过表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞外泌体刺激的HM 再次分泌的外泌体（SNCA-HM Exo）是否能通过miRNAs 调控受体神经细胞的自噬功能，我们对这些HM 外泌体内含的miRNAs 进行芯片分析。结果显示，被过表达α-synuclein 的SH-SY5Y 细胞外泌体以及对照组外泌体分别刺激的HM 分泌的外泌体中存在表达差异2 倍以上的miRNAs，我们筛选出差异表达最显著的20 个miR⁃NAs，其中表达上调与表达下调的miRNAs 各10 个（表1），因为本实验芯片分析仅作为初筛，所以实验组与对照组的样本量均为1。为了验证芯片分析数据的可靠性，我们接着应用PCR对芯片分析初步筛选出的这20个miRNAs 进行验证，并进行统计学分析，最后确认其中15 个miRNAs 存在表达差异，其中7 个miRNAs 表达上调，8 个miRNAs 表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05；图2）。我们应用TargetscanHuman 7.1 及miRDBV5 两个数据库同时对这15个miRNAs 进行靶基因预测，结果显示差异表达的15个miRNAs的靶基因共有1 457个。

2.3 差异表达的miRNAs 的靶基因KEGG 和GO分析

我们应用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库对差异表达的miRNAs 的靶基因进行生物信息学分析，靶基因富集分值最高的十条信号通路见图3A 所示，其中富集于PI3K-Akt 信号通路的靶基因共有46 个（图3A）。富集于PI3KAkt 信号通路的46 个靶基因及其对应的miRNAs详 见表2，其中hsa-miR-19a-3p 调控PI3K/Akt 信号通路相关的靶基因包括PTEN、ITGB8、PIK3CB、PPP2R5E、SGK1、THBS1、TSC1、CCND2（表2）。PI3K/Akt/mTOR 信号通路是调控自噬的重要通路。我们进一步应用GO（Gene Ontology）数据库对差异表达的miRNAs 的靶基因进行生物信息学分析，靶基因富集分值高的包括自噬等十条通路（图3B）。KEGG与GO 分析均提示靶基因与自噬密切相关，因此我们进一步研究了小胶质细胞外泌体通过miRNAs对SH-SY5Y细胞自噬的影响。

2.4 SNCA-HM Exo 激活PI3K/Akt/mTOR 信 号通路，抑制SH-SY5Y细胞自噬

为研究被过表达α-synuclein的SH-SY5Y细胞外泌体激活的HM分泌的外泌体（SNCA-HM Exo）是否能通过miR-19a-3p 调控PTEN，进而激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，最终抑制神经细胞自噬，我们将miR-19a mimic 以及miR-19a inhibitor 分别转染SH-SY5Y 细胞，观察它们对PTEN 以及PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白表达的影响。Western blot检测结果显示，Con-HM Exo+miR-19a mimic 组与SNCA-HM Exo 组PTEN（F=47.429，P＜0.001）、LC3Ⅱ/Ⅰ（F=64.295，P＜0.001）表达量与Con-HM Exo 对照组相比均出现下调，差异有统计学意义（P＜0.01；图4），而SNCA-HM Exo 同时加用miR-19a inhibitor 后PTEN（F=47.429，P＜0.001）、LC3Ⅱ/Ⅰ（F=64.295，P＜0.001）表达量与单纯SNCAHM Exo 组相比较，蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01；图4）；Con-HM Exo+miR-19a mimic 组 与SNCA-HM Exo 组p-Akt/Akt（F=57.852，P＜0.001）、p-mTOR/mTOR（F=40.435，P＜0.001）、P62（F=42.105，P＜0.001）表达量与Con-HM Exo对照组相比，均出现表达上调，差异有统计学意义（P＜0.01；图4），而SNCA-HM Exo 同时加用miR-19a inhibitor 后p-Akt/Akt（F=57.852，P＜0.001）、p-mTOR/mTOR（F=40.435，P＜0.001）、P62（F=42.105，P＜0.001）蛋白表达与单纯SNCA-HM Exo 相比较，均出现明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01；图4）。

图2 PCR验证小胶质细胞外泌体中差异表达的miRNAsFig.2 Identification of differentially expressed miRNAs in microglia exosomes by PCR

表1 两组小胶质细胞外泌体中差异表达的miRNAsTable 1 Differentially expressed miRNAs between GFP-con HM Exo and GFP-SNCA HM Exo

3 讨论

帕金森病是一种神经退行性疾病，它的的主要病理特点为Lewy 小体在多巴胺能神经元中的的形成和沉积以及这些多巴胺能神经元的变性和死亡。Lewy 小体的主要由α-synuclein 蛋白组成。α-synuclein蛋白还可以激活小胶质细胞，引发小胶质细胞的炎症反应［2］。异常活化的小胶质细胞可导致神经元自噬功能障碍，这是其导致神经元损伤的机制之一。自噬障碍都可导致异常细胞器的降解出现障碍，进而引发细胞变性死亡。研究发现，在帕金森疾病过程中增强自噬可以起到保护多巴胺能神经元的作用，这与自噬促进异常蛋白质和细胞因子的降解有关［3］。研究还发现［4］，自噬障碍可通过激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，激活炎症反应，加重帕金森病的进展和恶化。目前很多研究均表明，自噬障碍是帕金森病病理生理机制中的重要环节［5-6］，调控自噬有可能成为治疗帕金森病的新的重要手段之一［7］。

外泌体是一种细胞分泌的微小囊泡，其可通过在细胞间转移蛋白质、mRNA 和miRNAs 等物质发挥生物学功能。很多细胞，包括神经和小胶质细胞等均可分泌外泌体，外泌体可携带α-synuclein 蛋白在神经细胞与小胶质细胞之间传递［8-9］。我们既往研究发现［1］，过表达α-synuclein 的SH-SY5Y 细胞外泌体通过miRNA-19a-3p 调控PTEN 通路，进而抑制受体小胶质细胞自噬，从而上调α-synuclein对MAPK 通路的激活效应，促进小胶质细胞的异常激活。本文重点研究了小胶质细胞被过表达αsynuclein 的SH-SY5Y 细胞外泌体异常活化后对神经细胞自噬的影响及其机制，同时研究了小胶质细胞外泌体在其中的介导作用。

MicroRNAs（miRNAs）是一类小分子的RNA，通过与靶基因的3'端非编码区的碱基互补配对结合，抑制靶基因的翻译表达，发挥生物学功能。miRNAs调控靶基因表达广泛参与了帕金森病等神经退行性疾病的发病过程［10-11］，然而其调控机制并未明确。本文对被过表达α-synuclein 的SH-SY5Y细胞外泌体异常激活的小胶质细胞分泌的外泌体中的miRNAs 进行芯片分析，研究了小胶质细胞外泌体中的miRNAs对神经细胞自噬功能的影响。

图3 小胶质细胞外泌体中差异表达的miRNAs的靶基因KEGG分析Fig.3 KEGG and GO analysis of differentially expressed miRNAs in microglia exosomes.

我们通过miRNA 基因芯片技术检测发现，被过表达α-synuclein 的SH-SY5Y 细胞外泌体刺激的小胶质细胞分泌的外泌体（SNCA-HM Exo）与对照组外泌体之间存在表达差异的miRNAs，包括hsa-miR-19a-3p 等。通 过TargetscanHuman 7.1 及miRDBV5 两个数据库同时对差异表达最显著的miRNAs 的靶基因进行预测，并对靶基因进行KEGG 以及GO 分析，发现PI3K-Akt 信号通路是靶基因富集分值最高的信号通路，富集于PI3K-Akt信号通路的靶基因共有46 个。PI3K/Akt/mTOR 信号通路是自噬调控的重要通路之一［12］。mTOR 受到PI3K/AKt 信号通路的调控［13］。PI3K 被激活后可通过PIP3磷酸化AKT，使其活化，进而磷酸化TSC-2，抑制TSC-1 和TSC-2 复合物的形成，减少其对Rheb 的抑制作用，最终磷酸化并激活mTOR，产生自噬抑制。雷帕霉素（Rapamycin）可通过抑制mTORC1 诱导自噬。我们进一步对差异表达的miRNAs 的靶基因进行GO 分析发现，靶基因富集分值高的包括自噬等十条通路。KEGG 与GO 分析均提示靶基因与自噬密切相关，因此我们进一步研究了SNCA-HM Exo 通过miRNAs 对SH-SY5Y 自噬的影响。

表2 小胶质细胞外泌体中差异表达的miRNAs及其相应的富集于PI3K-Akt信号通路的靶基因Table2 Differentially expressed miRNAs in microglia exosomes and their corresponding target genes enriching in PI3K Akt signaling pathway

图4 Western blot 检测SH-SY5Y细胞PTEN及PI3K/Akt/mTOR自噬信号通路蛋白表达Fig.4 Expression of PTEN/PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins detected

外泌体miRNAs 芯片分析发现，miR-19a-3p等15 个miRNAs 在SNCA-HM Exo 中高表达。研究发现miR-19a-3p 可负向调控自噬［13］。miR-19a-3p可靶向NBR2，调控AMPK/PPARα 信号通路，进而抑制肝细胞的自噬［14］，同时可通过自噬抑制缓解缺血缺氧引发的心肌细胞损伤，或者通过靶向TGFβRII，进而抑制心肌细胞的自噬功能，由此减轻TGF-β1 诱导的心肌细胞纤维化［15］。研究还发现，miR-19a-3p 可通过靶向PTEN，调控PTEN/PI3K/Akt 信号通路，进而调控细胞凋亡、自噬等病理生理过程［16］。PI3K/Akt/mTOR 信号通路受到上游因子PTEN 的调控［17］，PTEN 是PIP3 磷酸酶，通过去磷酸化PIP3，抑制Akt 的磷酸化，促进自噬。研究发现，目前有很多细胞因子可通过PTEN 调控自噬，进而影响细胞的生物学功能［18］。PTEN是很多miRNAs 的靶基因，也是众多miRNAs 在基因层面上发挥生物学效应的重要调控靶点之一［19-20］。我们通过Targetscan 数据库对miR-19a-3p 的靶基因进行预测发现，miR-19a-3p 与靶基因PTEN 3’-UTR区域共有3个结合位点，而且此3个位点在不同种属中高度保守。故我们重点研究了SNCAHM Exo 能否通过miR-19a-3p 调控受体神经细胞PTEN/PI3K/Akt/mTOR 自噬信号通路，进而抑制神经细胞自噬。

我们通过Western blot 检测各组SH-SY5Y 细胞的PTEN及PI3K/Akt/mTOR 自噬信号通路相关蛋白表达，结果显示，Con-HM Exo+miR-19a mimic组与SNCA-HM Exo 组PTEN、LC3Ⅱ/Ⅰ表达量与Con-HM Exo 对照组相比均出现下调，而SNCAHM Exo 同时加用miR-19a inhibitor 后PTEN、LC3Ⅱ/Ⅰ表达量与单纯SNCA-HM Exo 组相比较，蛋白表达明显增加；Con-HM Exo+miR-19a mimic 组与SNCA-HM Exo 组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、P62 表达量与Con-HM Exo 对照组相比，均出现表达上调，而SNCA-HM Exo 同时加用miR-19a inhibitor 后p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、P62 蛋 白表达与单纯SNCA-HM Exo 相比较，均出现明显降低，这说明miR-19a-3p 模拟物和SNCA-HM Exo 均可下调受体神经细胞PTEN 的表达，由此激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，最终抑制神经细胞自噬。miR-19a-3p 抑制剂可阻断SNCA-HM Exo对PTEN、PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白表达以及自噬的影响，说明SNCA-HM Exo 可通过miR-19a-3p 靶向调控PTEN，进而调节PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达，最终抑制小胶质细胞的自噬功能。

综述所述，被过表达α-synuclein 的SH-SY5Y细胞外泌体激活的小胶质细胞重新分泌的外泌体可通过miR-19a-3p 靶向抑制PTEN，从而激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路，最终抑制神经细胞自噬。