CCK-8 对甲基苯丙胺诱导细胞凋亡的抑制作用

张武华，张明龙，景伟伟，谢冰，毕海涛，于峰，丛斌，马春玲，文迪

河北医科大学法医学院 河北省法医学重点实验室 河北省法医分子鉴定协同创新中心，河北 石家庄050017

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）是一种严重威胁公共健康和社会安全的兴奋性合成毒品，长期或高剂量使用会导致显著的神经损伤[1-2]。八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）是一种脑肠肽，可抑制METH诱导的氧化应激和神经炎症作用[3-5]。CCK-8 通过与胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）受体结合发挥作用，主要包括胆囊收缩素1 受体（cholecystokinin 1 receptor，CCK1R）和CCK2R两种亚型。同时，CCK-8 与CCK 受体结合后可激活β-制动蛋白（β-arrestin）偏向性信号途径，发挥抗凋亡作用[6-7]。本研究拟探讨CCK-8 参与METH 诱导神经元凋亡的受体机制以及β-arrestin偏向性信号途径在其中的作用，从而进一步阐明METH 的毒理学机制，为METH 滥用相关案件的法医学鉴识提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞（上海拜力生物科技有限公司），人胚肾细胞HEK-293［青旗（上海）生物技术发展有限公司］。DMEM 培养基、DMEM/F-12 培养基、Opti-MEMTMI 减血清培养基（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。METH 由北京市公安局提供。CCK-8（26-33，德国Merck 公司）。鼠抗Bax、鼠抗Bcl-2、鼠抗caspase-3/p17/p19、鼠抗β-actin（美国Proteintech Group 公司），兔抗CCK-AR（F-6）、兔抗CCK-BR（E-3）（美国Santa Cruz Biotechnology 公司），兔抗β-arrestin 2（C16D9，美国Cell Signaling Technology 公司），兔抗cleaved caspase-3（Asp175，美国Affinity 公司），羊抗鼠二抗（IRDye800CW）、羊抗兔二抗（IRDye700CW）（美国LI-COR 公司），羊抗兔IgG 二抗（DyLight 594 荧光标记）、羊抗兔IgG 二抗（DyLight 488 荧光标记）（武汉Abbkine Scientific 公司）。FITC Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit Ⅰ（美国BD 公司）。Hoechst 33258 溶液（德国Merck 公司）。聚凝胺（polybrene）助转染试剂［汉恒生物科技（上海）有限公司］，LipofectamineTM2000 CD 转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。慢病毒空载体LVCMV-mCherry-WPRE、LV-CMV-EGFP-WPRE 和 慢病毒过表达载体LV-CMV-mCherry-CCK1R-Flag-WPRE-pA、LV-CMV-EGFP-CCK2R-HA-WPRE-pA均由武汉枢密脑科学技术有限公司合成。

FACSAriaTMⅢ细胞分选仪（美国BD 公司），Odyssey 双色红外……