膀胱穿刺诊断间质性膀胱炎的动物实验研究

何江枢，陈 林，刘 迅，董陶涛，何平林,罗 旭,陈书练，杨 进

(1.遵义医科大学附属医院，贵州遵义 563000；2.成都大学附属医院泌尿外科，四川成都 610081)

间质性膀胱炎(interstitial cystitis，IC)，也称膀胱疼痛综合征(bladder pain syndrome，BPS)是一种以持续性疼痛为特征的综合征，与膀胱有关，伴有尿频或尿急，临床表现多种多样[1]。基于人口研究表明,女性与男性的比例大约为5∶1，甚至较高，并且通常伴发睡眠功能障碍、焦虑、抑郁和性功能障碍，严重影响患者的生活质量[2]。根据一些研究报道，IC与自身免疫、感染、上皮损伤、毒素和肥大细胞浸润等因素存在一定关联[3]。

环磷酰胺(cyclophosphamide，CYP)作为IC造模中最常使用的一种药物，CYP模型概括许多IC/BPS的典型特征，不仅造成的炎症效果较好，而且在稳定性上具备明显优势，得到国内外的广泛认可[4]。但CYP通常用作腹腔注射，并未直接接触到膀胱黏膜，因此造成的炎症效果可能不是最佳的。而IC造模的实验动物与以往比较几乎无变化，犬用作IC造模的报道少之又少。因此本研究在CYP模型基础上加以创新，利用儿童硅胶导尿管(F12)向犬膀胱内灌注CYP溶液来建立IC模型，同时模拟膀胱穿刺诊断人类IC的过程，这可能为研究和诊断IC提供一个全新的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性比格犬6只(6～8个月，10～15 kg),购自成都达硕实验动物有限公司。所有比格犬均在同一认证设施下饲养，环境、湿度和温度都有控制，光∶暗周期为12∶12 h。在标准的实验室条件下，每个笼子1只，自主获得食物和水。所有的实验程序和实验设计都是按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行的。成都大学附属医院伦理委员会批准所有动物实验(许可证号：LL/KY-201502-03)。为尽可能减少动物的痛苦，所有手术都是在肌肉注射戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉下进行的。

1.2 实验设计将6只雄性比格犬按完全随机设计法分成对照组(n=3)、实验组(n=3)，肌肉注射戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉后，对照组通过儿童硅胶导尿管(F12)向膀胱内灌注生理盐水30 mL，实验组通过儿童硅胶导尿管(F12)向膀胱内灌注CYP(0.2 g)溶液30 mL，每周灌注1次，维持3周。在第4周使用一次性活检穿刺针在超声引导下经腹部皮肤逐层穿刺至膀胱全层，并用40 g/L多聚甲醛溶液固定膀胱穿刺组织，观察实验组与对照组膀胱组织染色及肥大细胞浸润情况。此外，当出现严重血尿、尿量减少等症状时，我们根据这些症状重新分级，以确定膀胱过度损伤的恶化程度及是否进行人道终止。在所有实验结束后，我们用戊巴比妥钠对犬实施安乐死。

1.3 导尿及膀胱灌注的方法因造模试剂CYP必须进入膀胱方能起预期作用，故膀胱灌注操作是本实验所必须的操作。将犬用戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉后，腹部向上置于实验台，固定四肢，嘴用特制嘴套固定。将耻骨前方皮毛备皮，暴露尿道口，用碘伏棉球擦拭尿道口及周围皮肤[5]。取儿童硅胶导尿管(F12)作为犬导尿管。导尿管前段用石蜡润滑后沿尿道口缓缓插入，当见有尿液流出说明已进入膀胱。连接注射器抽取膀胱内尿液，力度需轻防止损伤。之后可选择生理盐水或磷酸盐缓冲液进行膀胱灌洗以提高实验的可靠性[6]。换用新注射器将造模试剂CYP注入，灌注速度控制在2 μL/s可以防止损伤和膀胱输尿管反流的发生[6]。

1.4 组织HE染色在灌注后第4周使用一次性活检穿刺针在超声引导下经腹部皮肤逐层穿刺至膀胱全层后，将穿刺的膀胱组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定后梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片(5 μm)，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，显微镜下观察膀胱炎症情况。

1.5 组织甲苯胺蓝染色将膀胱组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，常规脱水、包埋。石蜡切片经甲苯胺蓝液(甲苯胺蓝0.2 g，体积分数为60%的乙醇50 mL)染色，脱水、透明，中性树胶封片，并采用Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)软件进行分析。

2 结 果

2.1 膀胱组织HE染色对照组可以看到膀胱黏膜上皮完整，没有明显的损伤；实验组在CYP刺激后可以看到膀胱黏膜上皮破坏、脱落，黏膜下层明显增厚，炎症细胞浸润增多(图1)，说明CYP造成的炎症效果比较明显。

A：对照组；B：实验组。图1 对照组和实验组灌注后第4周穿刺膀胱组织(HE,×30)

2.2 肥大细胞特殊染色IC是一种慢性无菌性膀胱炎症，其病理上无特异性表现，与一般膀胱慢性炎症唯一的特征性区别是膀胱组织可见较多的肥大细胞，并呈脱颗粒表现[7-8]。因此本实验用甲苯胺蓝试剂检测膀胱组织中脱颗粒肥大细胞的浸润情况来检验犬模型能否达到预期结果。从图2中我们可以看出，周围组织背景清晰，实验组与对照组相比肥大细胞浸润明显增多，红色箭头所指为肥大细胞。通过Image-pro plus 6.0(Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA)软件进行分析计算每平方毫米内肥大细胞的数量(表1)。

A：对照组；B：实验组。图2 对照组和实验组第4周穿刺膀胱组织(甲苯胺蓝染色,×40)

表1 实验组和对照组每平方毫米内肥大细胞的数量

3 讨 论

虽然当前细胞生物学和分子生物学等研究方法高速发展，然而为了观察和检测机体的协调活动和整体状态，使用动物模型模拟病理状态的方法仍然是必不可少的[9]。在过去的几十年，大约有20多种动物模型制备出来[4]，而以往报道了一些IC的实验动物模型在制作上仍存在一些不足之处。例如，当前较新颖的是通过向大鼠膀胱灌注10 mg硫酸鱼精蛋白+750 μg脂多糖，但鱼精蛋白这类物质是非选择性的，会破坏细胞膜，导致细胞裂解[10-11]；IZGI等[12-13]通过向小鼠注射UPK3A 65-84肽或伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)诱发主要的IC表型，其效果较好，但由于UPK3A 65-84肽制备成本较高，PRV稳定性较差，因此未得到大面积推广。尽管最常用的实验动物鼠，从一定程度能模拟人体，但是对于IC膀胱内药物滴注模型而言，需要反复经尿道灌注药物，而鼠尿道狭窄，特别是小鼠从操作上来说有一定的操作难度及尿道狭窄可能[10]。猫科动物由于病因不明确，以及后期处理和维持的成本相对较高，因而使用受限[14]。再加上人类状况本身的复杂性，几乎现有动物模型都不能完全重现人类的所有症状，而只能更加接近地模拟IC的病理生理[14-15]。

对于IC模型，目前造模方式比较符合人们对于IC认知的是膀胱内药物滴注模型。这类模型通过导管或者导尿管直接将药物送至膀胱，作用于膀胱黏膜引起炎症，机理简单，成本较低，能够很好地还原人类IC的表型，但一般表型维持时间短，因此需要多次灌注[16]。而有研究表明，CYP作为最常用的造模药物，反复给予低剂量CYP，可以很好地诱发IC患者的疼痛症状及下尿路症状，而不会出现出血等病理改变[17-18]。根据国内外相关报道，此类模型应用最多，是一种经过充分研究的模型，其在稳定性及可操作性上具备独特优势。因此本研究将造模药物CYP与膀胱内药物灌注造模方式相结合。同时本文以犬作为实验动物，既能够诱导出慢性炎症，延长表型维持时间，也能解决因小鼠尿道插管引起的尿道损伤、狭窄、炎症及存在的技术问题，以及长期注射CYP后引起小鼠膀胱尿路上皮增生、改变等病理问题。在实验中，我们还模拟膀胱穿刺诊断人类IC的过程，在将犬麻醉和皮肤消毒后，通过超声引导下经腹部皮肤逐层穿刺至膀胱全层，这样使取得的膀胱组织更加符合人类组织活检的临床过程。

在本研究中，我们建立了一种新的IC动物模型，这种新的模型与人类IC的临床和组织病理学特征非常相似，通过与对照组相比发现具有以下特点：膀胱壁全层慢性炎症细胞浸润，尿路上皮变薄或部分缺失，肥大细胞浸润明显。然而，实验仍存在一些不足之处，例如使用一次性活检穿刺针穿刺膀胱组织仍有取到其他组织的可能，这样可能造成实验数据不准确或得出错误的数据。此外，由于穿刺针逐层取得的膀胱组织往往比较细小，因此做组织切片时层次可能被破坏，影响实验的结果。犬作为实验动物，虽然与鼠相比在操作上有一定优势，但犬的经济成本较高，且犬在实验过程中不易控制，有一定危险性。我们在接下来的实验中将对这些不足之处做进一步改进和优化。

根据目前研究结果，犬膀胱内CYP诱导的IC模型可能是一种相对持久的膀胱炎模型，能够更好地反映膀胱炎的病理发生发展过程。因此，建立一种有效的IC/BPS模型对其潜在的治疗方法的检测具有重要意义。

本研究表明通过间歇性地向犬膀胱内灌注CYP可诱导膀胱产生相对持久的炎症，组织中慢性炎症细胞浸润，其中肥大细胞浸润明显，而且这种新的慢性膀胱炎模型与人类BPS的临床和组织病理学特征有较高的相似度。因此，我们建立的CYP诱导的犬膀胱炎模型不仅能够模拟膀胱穿刺诊断人类IC过程，而且也能更好地模拟人类IC的发生、发展过程，它有可能成为BPS等慢性膀胱炎的病理研究和诊断的一种潜在的有价值的模型。