非编码RNA在神经内分泌前列腺癌中作用的研究进展

王 起，武士琪，吴开杰

(西安交通大学第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061)

前列腺癌是我国男性最常见的恶性肿瘤之一。神经内分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)是前列腺癌的一种特殊亚型，涵盖从局灶具有NEPC细胞的前列腺腺癌(prostatic adenocarcinoma，PAC)到纯小细胞神经内分泌癌的一系列表型。正常的前列腺组织主要包含管腔细胞、基底细胞和位于基底层的神经内分泌细胞(占1%)，参与前列腺上皮细胞的调节、分泌、分化和增殖[1]。原发性NEPC罕见(约0.5%～2%)，多数由PAC经神经内分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)而来，这被视为前列腺癌的一种适应性反应或耐药机制。在特定条件下，腺癌细胞发生NED，通常表现为雄激素受体(androgen receptor,AR)表达降低，并表达NED标志物如突触泡蛋白(synaptophysin,SYP)、嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CgA)及神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)等，成为NEPC细胞。雄激素阻断治疗(androgen deprivation therapy，ADT)特别是新型内分泌治疗，例如恩杂鲁胺(enzalutamide，Enz)等，可促进NED发生。此外，缺氧、细胞因子(例如IL-6)、生长因子、cAMP等均可在体外诱发NED。

NEPC具有高度侵袭性和转移性，对激素治疗不敏感，化疗效果短暂，多数患者生存期少于1年，代表着前列腺癌的终末阶段。同时，由于NEPC在病理标本的获取上存在较大困难，通常依赖前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)反常的低水平和肿瘤转移特征诊断，诊断效率低。因此，确定NEPC的分子机制，探索其诊断标志物及治疗靶点，预防或延缓其发展是目前临床诊疗的主要需求。近年来大量研究表明，非编码RNA在细胞中具有重要的调控作用，尤其是在肿瘤的发生、进展、转移和耐药中扮演了关键的角色[2]。目前，在前列腺癌及NEPC发生发展中起调控作用的研究主要集中在microRNA(miR)、lncRNA及circRNA,本文将围绕此3种非编码RNA在NEPC中作用的最新进展予以综述。

1 miR通过多种途径参与NEPC调控

1.1 miR简介miR是一类长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，可与mRNA靶标的3’端非编码区结合，通过抑制翻译或降解靶mRNA来阻碍合成基因表达，抑制蛋白质的合成，在转录后的基因调控中发挥作用[3]。miR深度参与细胞增殖、凋亡、代谢等关键细胞功能[4]。目前，肿瘤miR谱被用来定义相关的疾病亚型、监测患者生存期和治疗效果。在前列腺癌中，目前发现有数种miR能够调节肿瘤的进展、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和转移[5]。在NEPC调控方面，miR可激活经神经内分泌基因，促进NED、癌症转移及肿瘤耐药。

1.2 miR在NEPC中的调控作用

1.2.1双重调控作用 对PAC细胞和体外诱导的NEPC细胞的微阵列分析显示NED可造成mRNA和miR表达的广泛改变，根据其调控靶点的不同，miR可作为致癌因子或抑制因子参与NEPC的生物学过程[3]。miR在NEPC发生发展的不同阶段也存在双重作用。细胞系和PDX模型中发现miR-204在PAC阶段表现为肿瘤抑制因子，在NEPC中则起致癌作用，调控癌细胞生长和集落形成。实验发现腺癌细胞中存在AR/miR-204/XRN1/miR-34a正反馈环，其在前列腺癌中作用的阶段性差异主要依赖AR表达的改变：PAC阶段AR高表达，雄激素可抑制miR-204表达从而上调XRN1，后者则通过靶向miR-34a来上调AR的表达，同时miR-34a还可抑制癌细胞中CD44的表达。ADT可导致AR表达下调，此时miR-204高表达不仅会通过反馈抑制AR，同时也可下调XRN1以促进CD44的表达。CD44的表达与AR阴性均为NEPC的细胞特征，说明miR-204可能参与并促进ADT诱导的NED[6]。

1.2.2调控NEPC生物学改变 在ADT诱导前列腺癌细胞休眠及复发的研究中，分别用LTL-313B和LTL-331模型模拟PAC发展到去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)和NEPC的临床进展过程，并对这2个模型在去势前、去势后休眠、去势后复发3个阶段的全基因组miR表达谱分析，发现miR-100-5p在ADT压力环境中上调，并参与癌细胞休眠和NED发生。在AR-细胞中，miR-100-5p可以通过下调pRb信号通路中的SMARCA5、BAZ2A和THAP2等来刺激快速增殖[4]。此外，通过二代测序发现miR-652的高表达也与前列腺癌的高复发率显著相关。miR-652的过表达在PC3和LNCaP细胞系中导致肿瘤生长、迁移、侵袭性增加，在前列腺癌PDX模型中则表现出更高的致瘤性和转移潜能。miR-652直接靶向肿瘤抑制物PP2A的β调节亚基PP2R3A，从而激活PI3K/AKT、ERK-1/2和Wnt通路，促进肿瘤生长和转移，并诱导PC3细胞EMT和LNCaP细胞的NED。在过表达miR-652的PC3细胞中，间充质标记物N-钙黏素增加而上皮标记E-钙黏素减少；而过表达miR-652的LNCaP细胞和PDX模型中NE标志物明显增加。EMT和NED在NEPC细胞中与AR通路抑制同时发生[7]，提示miR-652可能通过抑制PP2A功能，激活下游的通路，在PAC阶段和NEPC阶段发挥不同的调控作用，但均促进前列腺癌向NEPC进展[8]。

1.2.3参与调控NED的癌基因 扩增和抑癌基因的突变或缺失可导致PAC向NEPC进展，此前的研究证实MYCN和AURKA扩增、RB1及TP53缺失促使NEPC发生[9]。p53基因突变可导致前列腺癌细胞内miR-25的表达上调，后者可以抑制E3泛素连接酶Fbxw7，从而增加AUKRA的表达，促进小细胞神经内分泌癌(small cell neuroendocrine carcinoma,SCNC)的增殖和侵袭[10]。N-Myc在前列腺癌中过表达，YIN等[11]的研究发现N-myc在PAC阶段和CRPC阶段通过miR-421/ATM通路发挥不同作用，在PAC细胞中N-MYC的过表达通过上调miR-421抑制ATM，从而阻止ADT诱导的细胞凋亡，在CRPC阶段miR-421受N-MYC和EZH2作用下调，其下游ATM表达增高，引起肿瘤迁移和侵袭性升高，并导致Enz耐药。免疫与代谢失调是癌症发生的关键因素之一，针对前列腺癌细胞募集肥大细胞的研究发现，浸润的肥大细胞能够靶向AR，一方面上调IL-8等趋化因子以正反馈促进PAC招募肥大细胞，另一方面升高miR-32在PAC中的表达，导致PAC细胞的形态改变和经神经内分泌标志物表达上调，促进NEPC发生。该研究同时证明Enz对AR的靶向作用亦可通过AR/IL-8和AR/miR-32通路分别促进肥大细胞募集和NEPC发生[12]。此外，较早的研究还发现miR-106b～25簇、miR-663、miR-221等可参与诱导PAC发生NED[8]。

2 lncRNA参与NEPC的生物学进程

2.1 lncRNA简介长链非编码RNA(lncRNA)定义为长度超过200个核苷酸的非编码RNA，与mRNA相比，lncRNA的表达水平较低，并具有更显著的组织特异性[13]。近年来测序技术的进步推动着lncRNA的发现及其功能研究，lncRNA通过转录过程、转录后调节、表观遗传学[14]等机制在正常生长发育和疾病发生发展中发挥作用。lncRNA表达失调是驱动肿瘤发生发展的因素之一，因此被认为是具有潜力的癌症生物标志物，在前列腺癌方面，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已批准1种lncRNA-前列腺癌抗原3作为临床诊疗中新的诊断标志物[13]。lncRNA在NEPC生物学过程中的角色正在探索中。

2.2 lncRNA的调控作用

2.2.1表观遗传调控 新型抗雄激素药Enz等对治疗CRPC有效，但会促进NED的发生。lncRNA-p21是1种在PAC细胞系和NEPC细胞系中差异表达的lncRNA，通过在Enz/AR/lncRNA-p21/EZH2/STAT3轴中发挥正向调控作用，参与Enz诱导的NED。Enz可诱导lncRNA-p21在PAC及NEPC细胞系中显著上调，伴随神经内分泌标志物的表达升高。EZH2是表观遗传效应因子PRC2的核心单元，是1种组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶，一般通过甲基化H3K2改变下游不同靶基因表达[7]。lncRNA-p21可与EZH2结合，同时抑制EZH2与另一对PRC2有稳定作用的lncRNA-HOTAIR的结合，从而降低PRC2核心亚基间的相互作用、干扰PRC2形成，并增强EZH2的甲基转移酶活性。实验证明AKT可磷酸化EZH2并促进STAT3甲基化，而lncRNA-p21能够作为AKT和EZH2的支架促进二者相互作用。此外，lncRNA-p21还能够促进EZH2和STAT3相互作用。由此可见lncRNA-p21在该通路上发挥着多种功能，增强了STAT3的甲基化，诱导了NED发生[15]。如前所述，HOTAIR能够与PRC2复合物相互作用，并参与随后的生物学过程，这一功能与癌症发展密切相关，能够驱动CRPC的发展[16]。CHANG等[13]的研究认为HOTAIR通过多种机制参与了NED的发生。HOTAIR是神经元限制性沉默元件REST的下游靶向RNA，REST在NEPC中发挥核心作用。体外实验证实HOTAIR在NE表型的CRPC细胞系中显著上调，并与经神经内分泌标志物的表达提高同步，敲低HOTAIR基因可导致IL-6诱导的NED被抑制，由此推测HOTAIR参与调控IL-6诱导的NED过程。此外，对过表达HOTAIR的PAC细胞系和CRPC细胞系中失调基因的Go分析识别出了自噬途径，且在HOTAIR过表达的LNCaP细胞中发现了自噬相关基因的表达上调。自噬在IL-6诱导的NED及NEPC的化疗耐药中具有关键作用[17]，说明HOTAIR可能在自噬途径上对NEPC的发生发展具有调控作用。

2.2.2参与AR表达的调控 AR表达的降低是NEPC的经典特征，并被认为是腺癌细胞发生NED的重要因素之一。但部分研究发现治疗诱导性NEPC细胞中可保留有AR表达[14,18]，提示表观调控可能参与影响NEPC中的AR表达。lncRNA-LBCS高表达可恢复CRPC细胞对新型内分泌治疗药物(例如比卡鲁胺)的敏感性，并与前列腺癌的良好预后相关。LBCs在CRPC中显著下调，且其表达与AR表达及PSA水平呈负相关，机制研究发现LBCs能够作为支架与RNA结合蛋白hnRNPK及AR mRNA相互作用，形成复合物，以此抑制AR表达。此外，其他lncRNA如HOTAIR和ARLNC1亦通过不同机制调控AR表达[19]。这些lncRNA对AR表达的调控并未证实与NEPC中AR的保留或丧失直接相关，但相关机制研究提示了非编码RNA参与调控NEPC中AR表观调控的可能性。

2.2.3肿瘤转移和不良预后 CREA等[14]通过微阵列分析发现lncRNA-MIAT在NEPC细胞系中与SYP同时高表达。数据库分析提示MIAT在前列腺癌转移灶中显著上调，并与Rb基因突变呈正相关。该研究认为MIAT可以与polycomb蛋白和Rb通路相互作用，同时研究还发现与MIAT正相关的基因涉及不良预后及转移瘤形成，而雄激素依赖基因、胚胎干细胞沉默基因和HIF1靶基因等则与MIAT负相关，表明MIAT的上调与NEPC的多个分子生物学特征相关。

针对lncRNA的表达水平较低的问题，RAMNARINE等[20]运用改良的二代测序技术提高了对低表达转录产物的敏感性，并建立了关于lncRNA的全基因组目录，将此应用于927个临床样本和LTL331模型，在NEPC中识别出了821种lncRNA，有121种在NEPC中显著差异，并筛选出表达量最高几种lncRNA，包括H19和LINC00617，以及与预后不良相关的LINC00514和SSTR5-AS1以及与转移相关的FENDRR。

3 circRNA是NEPC的潜在调节因子

3.1 circRNA简介circRNA是一类具有共价闭环结构的非编码RNA，广泛存在于各种组织和器官中。与线性RNA不同，circRNA的3’端和5’端连接在一起形成闭环结构，能够抵抗外切核糖核酸酶的降解，具有高度的稳定性和保守性。circRNA在生物体具有多种功能，包括分子海绵作用、顺式基因调控作用、通过竞争关系调控线性RNA的生成、参与蛋白质的翻译、作为自噬调节剂等[21]。circRNA广泛参与包括癌症在内的各种疾病的发生和发展，其数量及功能可影响恶性肿瘤的发生、生长、侵袭、转移、凋亡和血管生成等生物学过程，测序技术的更新发展使其展现出成为各类恶性肿瘤新的生物标志物或治疗靶点的潜力。circRNA在NEPC的发生和进展中的作用尚缺乏针对性的研究证据，但其对PAC的调控功能已有研究支持。

3.2 circRNA调控前列腺癌的侵袭和迁移circRNA可作为miRNA的分子海绵，通过竞争性结合miRNA的结合位点来调控miRNA的活性[2]，这是circRNA在癌症发生发展中最重要的机制之一，相关实验研究了该机制在不同系统肿瘤中的调控作用。最近的一项研究通过circRNA阵列分析发现，circABCC4在前列腺癌组织中表达上调，并与患者预后不良相关。circABCC4可作为miR-1182的内源竞争性RNA，通过分子海绵作用抑制miR-1182的表达来增加FOXP4的表达，导致前列腺癌的进展[22]。其他类似的研究报道了circITCH[23]、circMYLK[24]、circFOXO3[25]等多个circRNA通过对靶向miRNA的分子海绵作用参与调控前列腺癌的生物学过程。此外，circKATNAL1虽然对miR-145-3p具有分子海绵作用，但其促进了miR-145-3p表达并抑制了下游靶基因表达[26]，展现了1种新的调控机制。值得一提的是，部分circRNA在PC3细胞系与LNCap细胞系中存在表达差异，并与癌细胞的增殖、迁移和侵袭相关。PC3为典型前列腺NEPC细胞，分化程度低、不含有内源性的雄激素受体，常用于CRPC和NEPC的研究。同时，多种circRNA都在前列腺癌的侵袭和转移调控中发挥作用，而侵袭性和转移潜能升高是NEPC的显著特征，这些表现可能提示circRNA在NEPC发生发展中具有潜在的生物学功能。

此外，一项研究识别了4种AR来源的circRNA-circARs，这些circARs受雄激素抑制，在CRPC中显著上调，并在CRPC的Enz耐药进展过程中表达水平呈上升趋势[27]，提示circRNA可能参与NEPC的部分生物学过程，具备成为NEPC生物标志物和治疗靶点的潜力。

4 讨论与展望

NEPC是前列腺癌致命的终末阶段，但由于其AR非敏感性、低PSA表达、病理组织获取困难，晚期患者较少行穿刺诊断等原因，NEPC的诊断、监测和治疗面临瓶颈。测序技术的发展和生物学研究推进了非编码RNA及其生物学功能的发现。图1概括了非编码RNA从多方面参与对NEPC发生、发展的调控。此前也有文章讨论了NEPC的生物学改变、遗传学改变、表观遗传调控、转录调控及肿瘤微环境影响[7]，非编码RNA恰恰广泛参与到了这些分子生物学机制中，调控NEPC的发生发展。对这些作用机制的探究有助于推动NEPC诊疗方式的改进，并有希望提供新的诊断标志物或治疗靶点，以提升对这种高度恶性疾病的应对策略。

图1 非编码RNA参与NEPC发生、发展的示意图