多目标因素钝顶螺旋藻藻蛋白提取工艺分析

罗爱国，范瑶瑶, ，杨艳君，潘玉峰，胡变芳*

1. 晋中学院生物科学与技术学院（晋中 030600）；2. 山西大学生物技术研究所（太原 030006）

螺旋藻是水体中常见的生物，其所含营养物质十分丰富，药用价值极高[1]。在螺旋藻的众多品种中，钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）是其中最优良的品种之一[2-3]。钝顶螺旋藻是一种极具潜力的药食同源植物，对于很多疾病都具有防治作用，对人体免疫力和运动耐力方面具有促进作用，在肿瘤病毒上也有较强的抑制作用[4-6]。其中，藻蛋白为其主要营养成分，达60%～70%。但关于钝顶螺旋藻藻蛋白的提取工艺优化鲜见报道。

徐蕾然等[1]比较冻融、超声、磁力搅拌破壁对藻蓝蛋白提取效果的影响；侯兆乾等[7]将冻融法和超声法单独进行提取试验，探索出各自最佳提取条件后，开展先冻融再超声的提取试验，利用紫外分光光度计法测定藻蓝蛋白的浓度和提取率；徐润[8]比较水提法、缓冲液法和冻融法对藻蓝蛋白提取效果的影响。朱孝晨[9]采用反复冻融法提取螺旋藻藻蛋白；郝俊等[10]采用正交试验确立鄂尔多斯螺旋藻藻胆蛋白提取的工艺条件。

试验对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取工艺进行优化，以期为合理利用钝顶螺旋藻藻蛋白提供参考资料。所采用的原料为钝顶螺旋藻藻粉，通过单因素试验，将藻蛋白的提取率作为评定指标，通过改变浸泡时间、料液比、冻融时间、冻融次数探究其对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率有何影响，基于单因素试验，采用四因素三水平的正交试验探索最优工艺。

1 材料与方法

1.1 试验方法

1.1.1 制作标准曲线

参考表1，在试管中依次加入标准蛋白溶液和PBS缓冲液，让其充分混匀，分别编号1～7，将等量的考马斯亮蓝溶液分别加入，立即摇匀，静置5～20 min，测定595 nm处的吸光度，以1号管做空白对照，为保证试验客观性，把不同浓度都依次重复测量3次，求得平均值[11]。

表1 标准曲线的绘制

1.1.2 钝顶螺旋藻藻蛋白的提取及含量测定

取钝顶螺旋藻藻粉适量，浸泡在PBS缓冲液中，浸泡一定时间，在冰箱中冷冻、消融，反复冻融几次，离心，其上清液即为试验所需的蛋白提取液[12]。

使用移液枪取蛋白提取液0.1 mL，取5 mL考马斯亮蓝试剂，使其充分混合，静置15 min后，对其在595nm处的吸光度进行测定，为保证试验客观性，把不同浓度依次重复测量3次，取其吸光度的平均值，代入标准曲线方程，从而求出样品蛋白质浓度。

1.1.3 钝顶螺旋藻藻蛋白提取率的计算

根据式（1）计算钝顶螺旋藻藻蛋白提取率[11]。

1.2 试验设计

1.2.1 钝顶螺旋藻藻蛋白提取的单因素试验

1.2.1.1 浸泡时间

取钝顶螺旋藻藻粉2 g，按料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS缓冲液中，常温下浸泡2，6，10，22和48 h，在-18 ℃冰箱中进行冷冻（4 h），置于28 ℃光照培养箱中进行解冻（2 h），重复上述步骤4次，在4 000 r/min高速离心机中离心20 min，取其上清液即为蛋白提取液，测定吸光度，计算出藻蛋白提取率。

1.2.1.2 料液比

取钝顶螺旋藻藻粉2 g，浸泡在PBS缓冲液中（pH 6.8），将1～5号烧杯依次配置为料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）。在常温下浸泡22 h，充分溶解后在-18 ℃冰箱中进行冷冻4 h，置于28 ℃光照培养箱中解冻2 h，为保证细胞充分破壁，冻融4次，在4 000 r/min高速离心机中离心20 min，取其上清液即为蛋白提取液，测定吸光度，计算出藻蛋白提取率。

1.2.1.3 冻融时间

取钝顶螺旋藻藻粉2 g，料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS缓冲液中，常温下浸泡22 h，让其充分溶解后在-18 ℃冰箱中进行冷冻，分别冷冻0，2，4，6，8和10 h，将其放于28 ℃光照培养箱中解冻2 h，重复上述步骤4次，在4 000 r/min高速离心机中离心20 min，取其上清液即为蛋白提取液，测定吸光度，对藻蛋白提取率进行计算。

1.2.1.4 冻融次数

取钝顶螺旋藻藻粉2 g，按料液比1∶20（g/mL）溶解在pH 6.8的PBS缓冲液中，常温下浸泡22 h，在-18 ℃冰箱中冷冻4 h，置于28 ℃光照培养箱中解冻2 h，反复冻融0，2，4，6，8和10次，在4 000 r/min高速离心机中离心20 min，取其上清液即为蛋白提取液，测定吸光度，计算出藻蛋白提取率。

1.2.2 正交试验设计

将单因素试验的结论作为依据，根据正交试验的原理，以蛋白提取率为评定指标，分析影响藻蛋白得率的4个因素：料液比（A）、浸泡时间（B）、冻融时间（C）、冻融次数（D）。采用四因素三水平表正交试验，基于单因素试验结果，对每个因素都取3个水平，试验因素水平见表2所示。

表2 正交试验因素和水平

1.3 统计分析

统计分析在AS 9.0中进行，采用方差分析得到料液比、浸泡时间、冻融时间、冻融次数对钝顶螺旋藻藻蛋白得率的影响，并通过多重比较得到钝顶螺旋藻藻蛋白提取最优工艺参数。

2 结果与分析

2.1 不同因素对钝顶螺旋藻藻蛋白提取率的影响

2.1.1 不同浸泡时间对藻蛋白提取率的影响

由图1中可以看出，浸泡时间2 h，钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率最低，为18.24%，可能是因为此时藻粉未完全溶解在PBS缓冲液中；随着浸泡时间增加，藻蛋白提取率逐渐升高，浸泡时间6 h，藻蛋白提取率为19.4%；浸泡时间10 h，藻蛋白提取率为22.34%；浸泡时间22 h，藻蛋白提取率为23.23%；浸泡时间48 h，此时的藻蛋白提取率达到最高的24.01%。分析原因，可能是PBS缓冲液能够提供相对稳定的离子环境，而藻粉在PBS缓冲液中浸泡时间越长，越有利于细胞的破壁处理，从而得到较高的蛋白提取率。因此，在料液比、冻融时间和冻融次数相同的情况下，且试验允许的范围内，浸泡时间48 h时藻蛋白提取率最高，即藻蛋白提取率与藻粉浸泡时间成正相关。

图1 不同浸泡时间对藻蛋白提取率的影响

2.1.2 不同料液比对藻蛋白提取率的影响

由图2中可以看出，料液比1∶20（g/mL）时，藻蛋白的提取率最高，达到28.94%，说明此时的藻粉充分溶解在PBS缓冲液中，且在反复冻融的过程中细胞壁破碎的更加完全，故而此时的蛋白提取率最高；料液比1∶10（g/mL）时，钝顶螺旋藻藻蛋白提取率仅为22.23%，可能是由于藻粉无法完全溶解，而导致蛋白提取率较低；料液比1∶30（g/mL）时，藻蛋白的提取率逐渐降低，可能是随着提取液增加，很大程度上稀释原材料浓度，从而不利于蛋白析出。因此浸泡时间、冻融时间和冻融次数相同情况下，最佳料液比1∶20（g/mL）。

图2 不同料液比对藻蛋白提取率的影响

2.1.3 不同冻融时间对藻蛋白提取率的影响

由图3中可以看出，冻融时间0 h时，藻蛋白的提取率仅为7.41%，可能是钝顶螺旋藻藻粉经喷雾处理，部分细胞壁被破坏，加上PBS缓冲液的作用，部分藻蛋白易溶出；冻融时间2 h时，藻蛋白溶液并没有完全冰冻，而导致藻蛋白没有完全溶出，此时的提取率为23.6%；冻融时间增加至4 h，提取率升高至25.7%，因为冻融时间越长破壁细胞越多，溶出的藻蛋白更多，所以冻融时间增加至6 h时藻蛋白提取率最高，为27.7%，但随着冻融时间增加到8和10 h，藻蛋白含量变化很小，说明在该方法步骤下，藻蛋白溶出量趋近饱和，因此最适冻融时间为6 h。

2.1.4 不同冻融次数对藻蛋白提取率的影响

从图4中可以看出，冻融次数0次时，藻蛋白提取率为7.40%；冻融次数2次时，藻蛋白提取率为23.8%，说明通过冻融法破碎部分细胞；冻融次数4次时，藻蛋白提取率为26%，藻蛋白提取率有所提高；冻融次数6次时，藻蛋白提取率为27.1%，达到最高，说明在此条件下藻粉中细胞破壁完全，藻蛋白溶出量较多；冻融次数8次时，藻蛋白提取率为27.2%；冻融次数10次时，藻蛋白提取率为27.1%，此时的藻蛋白溶出量基本没有大幅变化；分析原因可能是，在料液比、浸泡时间和冻融时间相同情况下，随着螺旋藻冻融次数增加，蛋白质提取率逐渐增加，但冻融次数6次后，蛋白质提取率增加不明显，所以最适冻融次数6次。

图3 冻融时间对藻蛋白提取率的影响

图4 不同冻融次数对藻蛋白提取率的影响

2.2 正交试验优化

在单因素试验的基础上得出正交试验中各个因素的范围区间，将蛋白提取率作为评定指标，以料液比（A）、浸泡时间（B）、冻融时间（C）和冻融次数（D）这4个因素作为试验变量，观察这4个因素对评定指标的影响。结合单因素试验结果采用上述L9(34)表进行正交试验，对每个因素设置3个水平等级，对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取工艺进行优化。

表3 正交试验结果

表4为各因素对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率影响的方差分析结果，结果表明，4因素对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率都有显著影响（p＜0.05）。并且各因素主次顺序为冻融时间＞冻融次数＞浸泡时间＞料液比。

表4 正交设计方差分析表

根据表5的多重比较，处理2的钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率极显著的高于处理7、4、5、6、8、1。显著的高于处理3和9，处理3和9之间不存在显著的差异。所以处理2为最优提取工艺参数，即最佳提取条件为料液比1∶20（g/mL），浸泡时间22 h，冻融时间6 h，冻融次数6次。

表5 正交试验各处理多重比较的结果

3 结论与讨论

对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取工艺进行优化，从而达到合理利用螺旋藻藻粉的目的。采用钝顶螺旋藻藻粉为原料，通过单因素试验，将藻蛋白的提取率作为评定指标，通过改变浸泡时间（2，6，10，22和48 h）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））、冻融时间（0，2，4，6，8和10 h）和冻融次数（0，2，4，6，8和10次）这4种因素探究其对钝顶螺旋藻藻蛋白的提取率有何影响。基于单因素试验，采用四因素三水平正交试验，得出4个因素影响效果，即冻融时间最大，其次是冻融次数、浸泡时间，最后是料液比。得出反复冻融法的最优工艺条件为料液比1∶20（g/mL）、浸泡时间22 h、冻融时间6 h、冻融次数6次。

联合采用回归分析法，同时探求到每个因素对藻蛋白提取率的具体影响系数，试验结果可为藻蛋白提取工艺设计节约大量预处理时间，在工业生产上节约成本，为藻蛋白在食品、医药、饲料等领域的开发利用提供技术理论支持。